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Jun 02, 2023

Oberflächenmodifikation von Polycaprolacton-Nanofasern durch Hydrolyse und Aminolyse: eine vergleichende Studie zu strukturellen Eigenschaften, mechanischen Eigenschaften und zellulärer Leistung

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9434 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Hydrolyse und Aminolyse sind zwei häufig verwendete chemische Methoden zur Oberflächenmodifizierung von hydrophoben Tissue-Engineering-Gerüsten. Die Art der chemischen Reagenzien sowie die Konzentration und Behandlungszeit sind Hauptfaktoren, die die Auswirkungen dieser Methoden auf Biomaterialien bestimmen. In der vorliegenden Studie wurden elektrogesponnene Poly(ℇ-caprolacton) (PCL)-Nanofasern durch Hydrolyse und Aminolyse modifiziert. Die verwendeten chemischen Lösungen für die Hydrolyse und Aminolyse waren entsprechend NaOH (0,5–2 M) und Hexamethylendiamin/Isopropanol (HMD/IPA, 0,5–2 M). Für die Hydrolyse- und Aminolysebehandlungen wurden drei unterschiedliche Inkubationszeitpunkte vorgegeben. Den Ergebnissen der Rasterelektronenmikroskopie zufolge traten morphologische Veränderungen nur bei höheren Konzentrationen der Hydrolyselösung (1 M und 2 M) und längerer Behandlungsdauer (6 und 12 Stunden) auf. Im Gegensatz dazu führten Aminolysebehandlungen zu leichten Veränderungen in den morphologischen Merkmalen der elektrogesponnenen PCL-Nanofasern. Obwohl die Oberflächenhydrophilie von PCL-Nanofasern durch beide Methoden deutlich verbessert wurde, war der resultierende Einfluss der Hydrolyse vergleichsweise erheblicher. Als allgemeiner Trend führte sowohl die Hydrolyse als auch die Aminolyse zu einem moderaten Rückgang der mechanischen Leistung von PCL-Proben. Die energiedispersive Spektroskopieanalyse zeigte Elementveränderungen nach den Hydrolyse- und Aminolysebehandlungen. Die Ergebnisse der Röntgenbeugung, der thermogravimetrischen Analyse und der Infrarotspektroskopie zeigten jedoch keine merklichen Veränderungen nach den Behandlungen. Die Fibroblastenzellen waren gut verteilt und zeigten in beiden behandelten Gruppen eine spindelartige Form. Darüber hinaus verbesserten die Oberflächenbehandlungsverfahren laut dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay die proliferativen Eigenschaften von PCL-Nanofasern. Diese Ergebnisse zeigen, dass die durch Hydrolyse- und Aminolysebehandlungen modifizierten PCL-Nanofaserproben als potenziell günstige Kandidaten für Tissue-Engineering-Anwendungen angesehen werden können.

Tissue Engineering ist ein interdisziplinärer Ansatz, der darauf abzielt, die Reparatur und/oder Regeneration von verletztem Gewebe durch eine Kombination aus konstruierten Gerüsten, Zellen und geeigneten physikalisch-chemischen und biochemischen Wirkstoffen zu verbessern. Unter diesen Faktoren spielen Gerüste eine entscheidende Rolle im Regenerationsprozess, indem sie ein potenziell geeignetes Substrat für die Adhäsion, Proliferation, Differenzierung, Migration und Auslösung der gewünschten Funktionen der Zellen bereitstellen1,2.

Das Aufkommen von Nanomaterialien hat die Tissue-Engineering-Ansätze durch ihre inhärenten Fähigkeiten zur Entwicklung wünschenswerterer Gerüste revolutioniert. Nanostrukturen sind innovative Materialien mit genau maßgeschneiderten Eigenschaften, die als Gerüste und Vehikel zur Medikamentenabgabe in Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt werden können. In den letzten Jahren wurde eine breite Palette von Nanostrukturen für Anwendungen im Tissue Engineering entwickelt und evaluiert3,4,5. Unter ihnen haben elektrogesponnene Nanofasern aufgrund einiger einzigartiger Eigenschaften, wie z. B. einem hohen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, der Nachahmung der nativen extrazellulären Matrix (ECM) und der Möglichkeit, aus einer breiten Palette natürlicher, synthetischer und synthetischer Materialien hergestellt zu werden, beispiellose Beachtung gefunden halbsynthetische Polymere in unterschiedlicher Geometrie, Morphologie und Architektur6,7,8,9. Darüber hinaus können sie während oder nach dem Herstellungsprozess mit Arzneimitteln und einer Vielzahl therapeutischer Wirkstoffe beladen, eingebaut und funktionalisiert werden10,11,12,13,14.

Die erworbenen Nanofasergerüste aus natürlichen Polymerquellen haben eine vielversprechende Biokompatibilität, eine schnelle biologische Abbaurate und günstige Wechselwirkungen mit den Zellen gezeigt. Diese Strukturen leiden jedoch in der Regel unter der Variation des Ausgangspolymers von Charge zu Charge sowie unter schlechten mechanischen Eigenschaften des resultierenden Gerüsts15,16. Alternativ können Nanofasern aus einigen synthetischen Polymeren (Polyestern) wie Polyglykolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA) und Poly(ε-caprolacton) (PCL) vorteilhafte Kandidaten für Zwecke der Gewebezüchtung sein. Beispielsweise haben die aus PCL als halbkristallinem linearem Polyester erhaltenen Nanofasern ein großes Potenzial, die gewünschte mechanische Leistung zusammen mit der richtigen Biokompatibilität und dem richtigen biologischen Abbauverhalten darzustellen17,18.

Allerdings sind die hydrophobe Natur und das schlechte Zellhaftungsprofil der PCL-Nanofasern die Hauptnachteile, die die Anwendung von PCL-Nanofasergerüsten im Bereich der Gewebezüchtung ernsthaft behindern. Es ist klar bekannt, dass eine schlechte Oberflächenbenetzbarkeit der Nanofasermaterialien nicht nur deren Bioaktivität verringert, sondern auch zytotoxische Wirkungen hervorrufen kann19. Dementsprechend können PCL-Nanofasern kein ideales Gerüst sein, es sei denn, ihre Oberflächenbenetzbarkeit wird verändert. Glücklicherweise können diese Probleme weitgehend durch die Anwendung einiger unterschiedlicher Ansätze angegangen werden, wie z. B. Mischen oder Co-Elektrospinnen mit den bioaktiven Wirkstoffen oder natürlichen Polymeren, Oberflächenpfropfpolymerisation, Plasmabehandlung und nasschemische Modifizierungsmethoden20,21,22,23,24.

Das Mischen oder Co-Elektrospinnen mit natürlichen Polymeren ist eine weit verbreitete Technik zur Modifizierung PCL-basierter Nanofasergerüste. Es bestehen jedoch große Bedenken hinsichtlich der Unmischbarkeit natürlicher und synthetischer Polymere in herkömmlichen Lösungsmitteln sowie einer möglichen Inaktivierung bioaktiver Wirkstoffe während des Mischprozesses6,25,26. Darüber hinaus sind einige der bei diesem Ansatz am häufigsten verwendeten Lösungsmittel als biologisch gefährliche Materialien bekannt27.

Die Oberflächenpfropfpolymerisation bioaktiver Wirkstoffe ist ein bekannter Ansatz zur Modifizierung der Oberfläche von PCL-Nanofasern und zur Einführung multifunktionaler Funktionen in die Nanofasermembran. Der Erfolg dieser Methode hängt jedoch eng von der Verfügbarkeit dichter und ausgerichteter funktioneller Oberflächengruppen auf PCL-Nanofasern ab, die mit den bioaktiven Wirkstoffen interagieren können. Daher muss dieser Ansatz unter Verwendung wirksamer Oberflächenkonjugations-/Polymerisationstechniken durchgeführt werden, die nicht leicht zu erreichen sind28,29.

Auch die Plasmabehandlung ist ein bekannter Ansatz, der auf einem Niederdruckgasprozess zur Aktivierung der Oberfläche von PCL-Nanofasern basiert. Bei dieser Technik können verschiedene Einsatzgase wie Sauerstoff, Argon, Stickstoff und Kohlendioxid eingesetzt werden, um Carbonsäure-, Amin- und Hydroxylgruppen auf der Oberfläche der PCL-Nanofasern einzuführen. Die eingeführten funktionellen Oberflächengruppen können einige Eigenschaften der PCL-Nanofasern verändern, indem sie ihre Oberflächen aktivieren30,31. Ein großer Nachteil besteht jedoch darin, dass diese Modifikationstechnik nur eine oberflächliche Aktivierung der Nanofasermatten induziert und der Großteil der Probe nicht effizient modifiziert wird32.

Die nasschemische Modifizierung ist ein einfacher, unkomplizierter und effizienter Ansatz zur Oberflächenmodifizierung von PCL-Nanofasern. Estergruppen (–COO–) in der Mikrostruktur von PCL-Nanofasern können durch eine alkalische Behandlung leicht zu Hydroxyl- und Carbonsäuregruppen hydrolysiert werden. Es wurde nachgewiesen, dass diese Modifikation die Oberflächenbenetzbarkeit sowie das Zellverhalten der PCL-Nanofasermatten deutlich verbessern kann. Um dies zu veranschaulichen, haben Chen et al. führte zu einer offensichtlichen Verbesserung der Ausbreitung und Anhaftung von 3T3-Fibroblastenzellen, die auf oberflächenmodifizierten PCL-Nanofasern kultiviert wurden. Diese PCL-Nanofasern, die 3 Stunden lang mit 5 M NaOH-Lösung behandelt wurden, zeigten eine stark verbesserte Oberflächenbenetzbarkeit7. In einer anderen Studie stellten Park et al.33 dar, dass Osteoblasten auf den behandelten PCL-Nanofasern (1 N NaOH für 1 Stunde) im Vergleich zu den unberührten PCL-Nanofasern eine deutlich bessere Zellanhaftung und -proliferation aufweisen.

Darüber hinaus können durch Aminolysereaktionen unter Verwendung der Diaminverbindungen aktive Aminogruppen in die PCL-Nanofasern eingeführt werden. Bei diesem Prozess reagiert eine Aminogruppe mit der Estergruppe von PCL unter Bildung von –CONH– (einer kovalenten Bindung), während die andere Aminogruppe der Verbindung an der Oberfläche der PCL-Nanofaser hängt. Die so erzeugten Aminogruppen fungieren als Linker und beschleunigen die Anlagerungsstelle für Biomoleküle und andere bioaktive Wirkstoffe auf der Oberfläche von PCL-Nanofasern. Diese Fähigkeit kann der PCL-Nanofasermembran einige wertvolle Vorteile bieten, wie z. B. die Verbesserung der Hydrophilie und der Wasseraufnahmekapazität. Darüber hinaus könnten die aminolysierten PCL-Proben dank der neutralisierten sauren Nebenprodukte, die während des Abbaus entstehen, und besser zugänglicher aktiver Stellen für die Biokonjugation biologischer Moleküle und die Verankerung der Zellen eine bessere Biokompatibilität aufweisen34.

In der aktuellen Studie wurde eine Reihe hydrolysierter und aminolysierter Proben hergestellt und die möglichen Auswirkungen von Hydrolyse und Aminolyse auf die physikalische, mechanische und Zellkompatibilität von elektrogesponnenen PCL-Nanofasern vergleichend untersucht. Abbildung 1 zeigt schematisch den molekularen Mechanismus der chemischen Behandlungen, die in dieser Studie angewendet wurden35,36,37,38. Die Konzentration der reaktiven Wirkstoffe und die Reaktionszeit variierten, um die modifizierenden Auswirkungen der Behandlungsbedingungen auf PCL-Nanofasern zu vergleichen. Zu diesem Zweck wurden reine PCL-Nanofasermatten und die Vertreter der behandelten Proben vollständig unter mikrostrukturellen, mechanischen und zellulären Verhaltensaspekten untersucht.

Eine Darstellung des molekularen Mechanismus der Oberflächenmodifikationen (Hydrolyse- und Aminolysebehandlungen) für PCL-Nanofasern.

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopaufnahmen der reinen und modifizierten Proben wurden verwendet, um die strukturellen und morphologischen Eigenschaften der PCL-basierten Nanofasergerüste zu untersuchen. Die erhaltenen mikroskopischen Aufnahmen der hydrolysierten und aminolysierten PCL-Proben sind in den Abbildungen dargestellt. 2 und 3 entsprechend. Da das elektrogesponnene PCL-Gerüst die Basisplattform für die Herstellung der modifizierten Proben war, mussten seine morphologischen Merkmale genau untersucht werden. Wie von einem ordnungsgemäß hergestellten Gerüst erwartet, bezeichnet die PCL-Probe eine dreidimensionale poröse Struktur, die aus heterogenen, miteinander verbundenen Poren organisiert ist. Im Allgemeinen hatte das PCL eine kügelchenfreie Nanofaserstruktur mit glatten Nanofasern. Aus struktureller Sicht konnten in der Struktur der PCL-Probe nicht gewebte und zufällig orientierte Nanofasern klar unterschieden werden. Den entsprechenden Mikroaufnahmen (Abb. 2a) zufolge weisen PCL-Nanofasern eine wünschenswerte Oberflächenmorphologie im Hinblick auf ein glattes und gleichmäßiges Gerüst auf. Die Porosität und Porengröße der PCL-Probe wurden mit der Image J-Software zur quantitativen Untersuchung der porösen Struktur untersucht. Die Porosität und die mittlere Porengröße der PCL-Probe lagen bei etwa 43 ± 17 % bzw. 1512 ± 816 nm. Darüber hinaus wurde der durchschnittliche Faserdurchmesser der PCL-Probe mit 305 ± 148 nm berechnet, was mit den Ergebnissen früherer Studien übereinstimmt39.

FESEM-Bilder der PCL-Nanofaserproben, die mit unterschiedlichen Konzentrationen einer NaOH-Lösung und zu verschiedenen Inkubationszeitpunkten (1, 6 und 12 Stunden) behandelt wurden. (a) Unberührtes PCL, (b) S1, (c) S2, (d) S3, (e) S4, (f) S5, (g) S6, (h) S7, (i) S8, (j) S9 . Rote Pfeile zeigen strukturelle Defekte und Brüche von Nanofasern an.

FESEM-Bilder der PCL-Nanofaserproben, die zu verschiedenen Inkubationszeitpunkten (1, 12 und 24 Stunden) mit unterschiedlichen Konzentrationen einer HMD/IPA-Lösung behandelt wurden. (a) Unberührtes PCL, (b) S10, (c) S11, (d) S12, (e) S13, (f) S14, (g) S15, (h) S16, (i) S17 und (j) S18.

Bei hydrolysierten Proben, bei denen die Konzentration der Lösung konstant bei 0,5 M gehalten wurde, erfuhren PCL-Nanofasern keine drastische Änderung der Morphologie durch Verlängerung der Behandlungszeit (von 1 auf 12 Stunden). Genauer gesagt veränderte sich nicht nur die glatte und gleichmäßige Morphologie der PCL-Nanofasern erheblich, sondern auch der mittlere Faserdurchmesser und der Porositätsprozentsatz blieben relativ konstant. Beispielsweise lagen bei der S1-Probe der durchschnittliche Faserdurchmesser (314 ± 143 nm) und die Porosität (41 ± 12 %) nahe an den für die PCL-Probe erhaltenen Messwerten.

Bei 1 M NaOH blieb die Nanofaserstruktur nach einer einstündigen Behandlung intakt und fehlerfrei (S4-Probe). Durch Erhöhen der Inkubationszeit auf 6 und 12 Stunden (S5- und S6-Proben) trat jedoch eine abgeflachte Morphologie auf und die benachbarten Nanofasern waren räumlich gepackt. Beispielsweise zeigte der resultierende durchschnittliche Durchmesser der Nanofasern für die S6-Probe eine deutliche Änderung des Durchmessers auf 402 ± 276 nm, aber die Porosität dieser Probe (S6) war der PCL sehr ähnlich. Als die NaOH-Konzentration auf 2 M erhöht wurde und die Behandlungszeit 1 Stunde betrug (S7-Probe), wurden keine wesentlichen Veränderungen in der Nanofaserstruktur beobachtet. Als sich die Eintauchzeit jedoch allmählich auf 6 und 12 Stunden verlängerte (S8- und S9-Proben), wurden enorme Veränderungen auf der Oberfläche hydrolysierter Nanofasern beobachtet. Darüber hinaus wurde die gleichmäßige und glatte Struktur der Nanofasern zu einer raueren und heterogeneren Struktur verändert. Darüber hinaus wurden einige strukturelle Defekte und Brüche von Nanofasern auf der Oberfläche von PCL induziert, wie in Abb. 2i und j, rote Pfeile, dargestellt. Basierend auf weiteren Untersuchungen zeigte die Porosität von Nanofasern in der höchsten Eintauchzeit (S9-Probe) einen drastischen Rückgang auf 36 ± 18 %. Darüber hinaus wurde der durchschnittliche Durchmesser der Nanofasern in der S9-Probe mit 381 ± 409 nm berechnet.

Insgesamt deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass es zu einer Oberflächenerosion der Nanofasern und einer anschließenden Änderung des Faserdurchmessers kommen kann, wenn PCL über einen längeren Zeitraum einer höheren Konzentration an Hydrolyselösung ausgesetzt wird. Frühere Studien bestätigten diese Ergebnisse. In einer Studie von Yew et al.23 wurden PCL-Nanofasern unterschiedlich lange verschiedenen alkalischen Hydrolyselösungen ausgesetzt. Sie fanden heraus, dass es bei längerem Eintauchen in höhere alkalische Hydrolysekonzentrationen zu einer leichten Erosion und einer raueren Oberfläche der Fasern kam. Anschließend kam es zu einer Abnahme der durchschnittlichen Dicke der PCL-Nanofasermembran, um den Peeling-Effekt zu erzielen.

Im Hinblick auf die Einführung von Amingruppen auf der Oberfläche von PCL-Nanofasern wurde die Aminolyse genutzt und die Auswirkung dieser Behandlung auf die morphologische Struktur des PCL-Nanofasergerüsts untersucht (Abb. 3). Die REM-Bilder zeigten leichte Veränderungen in der Morphologie der Gerüste nach der Aminolyse. Es gab keinen bemerkenswerten Unterschied zwischen den behandelten Gerüsten bei verschiedenen Konzentrationen und Zeiten. In allen aminolysierten Proben verwandelte sich die glatte Oberfläche des PCL-Nanofasergerüsts in eine faltenartige Oberfläche und wurde teilweise rau. Darüber hinaus neigten die aminolysierten Nanofasern dazu, verschmolzene Nanofasern zu bilden. Darüber hinaus war der Durchmesser der aminolysierten Proben im Vergleich zu reinem PCL leicht erhöht. Zur Verdeutlichung zeigte die Analyse der S18-Probe einen Anstieg des mittleren Durchmessers von 350 ± 190 nm, was möglicherweise auf verschmolzene Nanofasern zurückzuführen war. Darüber hinaus wurde die Porosität aller aminolysierten PCL-Nanofasern verringert und erreichte Werte zwischen 24 ± 10 % und 37 ± 20 %. Diese Daten im Vergleich zu reinem PCL (Porosität 41 ± 12 %) deuten auf eine kompaktere Faserdichte hin.

Im Allgemeinen wird in Abb. 3 dargestellt, dass sich die Oberfläche der Proben teilweise verändert hat, diese Veränderungen sind jedoch nicht sehr stark, wie in der früheren Literatur40. Eine weitere Studie von Amoures de Sousa et al.41 bestätigte, dass sich die Morphologie der PCL-Nanofasern nach dem Aminolyseprozess nicht veränderte. In einer anderen Studie verwendeten Krithica et al. 10 % HMD/IPA 12 Stunden lang bei 37 °C, um stickstoffhaltige Gruppen auf den Nanofasern einzuführen. Sie berichteten, dass die Behandlung keine nachteiligen Auswirkungen auf die Morphologie der Nanofasern hatte42.

Die aktuelle Arbeit wurde verwendet, um die Wirkung von zwei Arten nasschemischer Behandlung (Aminolyse und Hydrolyse) auf die Eigenschaften des PCL-Gerüsts zu bewerten. Unsere Erkenntnisse aus REM-Aufnahmen funktionalisierter Proben ergaben, dass beide chemischen Behandlungen die morphologische Struktur des PCL verändert hatten. Wie oben erläutert, hatten Aminolyselösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen und Dauer einen ähnlichen Teileffekt auf die PCL-Probe. Im Gegenteil wurden diese Veränderungen für die hydrolysierte Probe auf die Konzentration der Behandlungslösung und die Zeitspanne zurückgeführt. Kurz gesagt, die Morphologie des PCL veränderte sich durch Eintauchen in eine alkalische Hydrolyselösung im Vergleich zur Aminolyselösung stärker.

Als wesentliches Kriterium für die Bewertung von Hydrolyse- und Aminolysebehandlungen wurde die Oberflächenbenetzbarkeit behandelter PCL-Nanofasermatten untersucht und mit makellosem PCL verglichen. In diesem Zusammenhang wurde die Analyse des Wasserkontaktwinkels (WCA) zu einem bestimmten Zeitpunkt (Sek. 5) angewendet, um einen quantitativen Vergleich durchzuführen (Abb. 4A und B). Der WCA für makellose PCL-Nanofaserproben wurde mit 135,09° ± 2,44° gemessen, was ein offensichtlicher Hinweis auf deren hydrophobe Natur war. Es wurde bereits nachgewiesen, dass die Hydrophobie der PCL-Probe auf ein optimales Niveau verbessert werden muss, um ein vielversprechendes Zellverhalten zu erzielen43. Grundsätzlich bietet eine ausgewogene Hydrophilie auf der Oberfläche ein großes Potenzial für die Entwicklung von mehr Verankerungsstellen für die anfängliche Adhäsion von Zellen. Eine ordnungsgemäße anfängliche Zelladhäsion kann zu einer besseren Zellbesiedlung auf der Oberfläche des Gerüsts führen, wodurch es für die Ausbreitung, Infiltration und Proliferation einer Vielzahl von Zellen besser geeignet ist44.

Wasserkontaktwinkelwerte der (A) hydrolysierten PCL-Nanofaserproben und (B) der aminolysierten PCL-Nanofaserproben.

Als allgemeiner Trend wurde die Oberflächenhydrophilie der PCL-Nanofasermembran nach den nasschemischen Behandlungen verbessert. Durch die Erhöhung der Konzentration der Behandlungslösungen und die Verlängerung der Inkubationszeit wurde eindeutig die Oberflächenbenetzbarkeit der PCL-Probe sowohl bei Hydrolyse- als auch bei Aminolyseverfahren verbessert. Das Ausmaß dieser Verbesserung war jedoch vergleichsweise unterschiedlich. Genauer gesagt führten die extremen Hydrolysebedingungen zu einer stärkeren Abnahme des WCA von PCL im Vergleich zu den extrem aminolysierten Proben. Dies war bei den S9- und S18-Proben deutlich zu erkennen, die einen WCA von 57,56° ± 5,61 bzw. 110,41° ± 0,68 aufwiesen.

Der Fall ist, dass die Induktion aktiver funktioneller Oberflächengruppen (–OH, –COOH, –NH2) die Hydrophilie von Nanofasern erheblich erhöhen kann. Ganz zu schweigen davon, dass hochfunktionalisierte Oberflächen über eine hervorragende Fähigkeit zur Aufnahme und Speicherung von Wassermolekülen verfügen. Darüber hinaus könnte eine beträchtliche Verbesserung der Hydrophilie hydrolysierter Nanofasern im Vergleich zu aminolysierten Nanofasern auf die höhere Spaltungsreaktion zurückzuführen sein, die bei Hydroxyl- und Carboxylgruppen in größerem Maße abbricht. Die Gesamtergebnisse bestätigten, dass Behandlungsmethoden die Benetzbarkeit von Proben wirksam verbesserten, was mit einigen früheren Studien übereinstimmt33,45,46,47.

Ein ideales Nanofasergerüst sollte über wünschenswerte mechanische Eigenschaften für den Einsatz in Tissue-Engineering-Anwendungen verfügen48. Daher war es von entscheidender Bedeutung, das mechanische Verhalten von PCL-Gerüsten zu bewerten. Zu diesem Zweck wurden PCL-basierte Nanofaserproben einer Bewertungsmethode unterzogen, die auf einem einachsigen Zugversuch bis zum Strukturversagen basiert. Die Zugfestigkeit (UTS), der Elastizitätsmodul und die Dehnung bei maximaler Spannung wurden aus den erhaltenen Spannungs-Dehnungs-Kurven für alle Proben gemessen. Um die Vergleiche zu vereinfachen und einen analysierbaren Trend festzulegen, werden nur ausgewählte Proben für Hydrolyse (S1, S5, S9) und Aminolyse (S10, S14, S18) weiter dargestellt und diskutiert. Die Ergebnisse für ausgewählte Proben sind in Abb. 5 zusammengefasst und die Ergebnisse für andere Proben sind in den Zusatzdaten dargestellt. Es ist erwähnenswert, dass Abweichungen in den Replikationsergebnissen für jede Probe unvermeidlich waren. Dies könnte auf die geringfügigen unvermeidlichen Änderungen im Elektrospinnprozess sowie auf schwerwiegende Fehler im Verfahren der mechanischen Prüfung zurückzuführen sein. Um die Auswirkungen dieser Faktoren zu minimieren, wurde daher versucht, den Herstellungsprozess und das Testverfahren streng zu überwachen, um mögliche Fehler zu reduzieren. Darüber hinaus wurden die erhaltenen Daten aus Replikationen jeder Probe gemittelt, wenn die abweichenden weggelassen wurden.

Spannungs-Dehnungs-Kurven und Tabelle der entsprechenden mechanischen Parameter für die (A) hydrolysierten PCL-Nanofaserproben und (B) aminolysierte Nanofaserproben. * Zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zur PCL-Stichprobe an (p < 0,05).

Als allgemeiner Trend gilt, dass die niedrigere Konzentration der NaOH-Behandlungslösung zusammen mit der kürzeren Inkubationszeit keinen wesentlichen Einfluss auf die mechanische Leistung der PCL-Nanofaserprobe (S1) hat. Im Gegenteil: Durch die Erhöhung der Konzentration der Behandlungslösung und der Inkubationszeit (S5 und S9) werden die mechanischen Parameter deutlich beeinflusst. Beispielsweise verringerte sich die Zugfestigkeit von makellosem PCL (2,73 ± 0,16 MPa) signifikant auf 2,07 ± 0,18 bzw. 1,75 ± 0,17 MPa für S5- bzw. S9-Proben (p < 0,05). Der gleiche Trend wurde für den Elastizitätsmodul beobachtet, als unberührtes PCL einen signifikanten Rückgang von 2,04 ± 0,11 MPa auf 1,36 ± 0,11 bzw. 1,32 ± 0,07 MPa für S5- und S9-Proben erfuhr. Bezogen auf den Dehnungsprozentsatz wurde jedoch lediglich in der S9-Kurve (70,6 ± 9 %) eine signifikante Abweichung vom PCL (94 ± 10 %) festgestellt.

Die oben genannten Schwankungen im mechanischen Verhalten von Proben lassen sich weitgehend durch die entwickelten Veränderungen ihrer Struktureigenschaften erklären, die in REM-Aufnahmen zu sehen sind. Beispielsweise kann die Tatsache, dass die Struktur der S1-Probe im Vergleich zu reinem PCL weitgehend erhalten blieb, der Hauptgrund dafür sein, dass sich die mechanischen Eigenschaften dieser Probe nicht wesentlich verändert haben. Bei der S5-Probe kam es jedoch zu einer gewissen Abflachung der PCL-Nanofasern, einer Verdichtung mit benachbarten Nanofasern und einigen Brüchen in ihrer Struktur, was zu einer leichten, aber erheblichen Verschlechterung der mechanischen Stabilität führen kann. In ähnlicher Weise wurde die mechanische Leistung der S9-Probe durch die enormen Veränderungen der Struktureigenschaften des PCL-Nanofasernetzwerks negativ beeinflusst. In diesem Fall haben Belastungsschäden an der Oberfläche von PCL-Nanofasern zusammen mit den deutlichen Störungen durch die miteinander verbundene Nanofaserstruktur der Probe zu einer unbestreitbaren Schwächung des mechanischen Verhaltens beigetragen. Es ist erwähnenswert, dass die erhaltenen mechanischen Ergebnisse für die hydrolysierten Proben weitgehend mit den Ergebnissen der Studie von Sonthaya Chaiarwut et al.48 übereinstimmten.

Abbildung 5B zeigt die Auswirkung verschiedener Aminolysebedingungen auf die mechanischen Eigenschaften von PCL-basierten Nanofaserproben. Die quantitativen Daten für PCL-, S10-, S14- und S18-Proben wurden aus den entsprechenden Spannungs-Dehnungs-Kurven erhalten. Im Allgemeinen hatten aminolysierte Proben im Vergleich zu PCL eine relativ geringere Zugfestigkeit. Beim Elastizitätsmodul konnte ein deutlicher Abwärtstrend von 2,04 ± 0,11 MPa für makelloses PCL auf 0,93 ± 0,18 MPa für S18 festgestellt werden. Die Variationen des Elastizitätsmoduls der Proben waren im Vergleich zum PCL statistisch signifikant. Nichtsdestotrotz stieg die Dehnung der aminolysierten PCL-basierten Proben für S10, S14 und S18 auf 126 ± 9, 117 ± 9 und 109 ± 10 %. Wie erwartet wurde die Steifigkeit offensichtlich verringert, wenn PCL-basierte Proben durch die Aminolysebedingungen modifiziert wurden, was auf erkennbare Änderungen in der Ausrichtung zufälliger PCL-Nanofasern hin zu einem geordneteren Netzwerk zurückzuführen war. Dies könnte der Faktor sein, der zur Verbesserung der Elastizität sowie zur Verringerung der Zugfestigkeit (Dehnung) in den aminolysierten Proben beiträgt. Im Falle einer deutlichen Abnahme des Elastizitätsmoduls von Proben wird angenommen, dass Aminolysebehandlungen möglicherweise die Struktur des PCL-Nanofasernetzwerks auf einer tieferen Ebene im Vergleich zur Hydrolyse beeinflussen können. In einer früheren Studie von Zhu et al.34 wurde eine HMD/IPA-Behandlungslösung für die Aminolyse der PCL-Membran verwendet, um freie NH2-Gruppen als aktive Stellen für die Konjugation von Gelatine, Chitosan oder Kollagen einzuführen. Sie erkannten, dass die Aminolysereaktion bis zu 50 µm tief in die Membran eindringen konnte; Infolgedessen wurde der Elastizitätsmodul der Proben deutlich verringert. In einer anderen Studie zeigten Toledo et al.49, dass eine Abnahme des Elastizitätsmoduls in PCL-Nanofaserproben nach einer Aminolysebehandlung mit Diaminen unvermeidlich ist. Darüber hinaus stellten sie fest, dass die Aminolyse durch HMD drastischere Auswirkungen auf den Elastizitätsmodul hatte als die anderen Diamine.

Eine Fourier-Transformations-Infrarot-Spektrometrieanalyse (ATR-FTIR) mit abgeschwächtem Gesamtreflexionsvermögen wurde durchgeführt, um betroffene funktionelle Gruppen auf den modifizierten Proben durch Hydrolyse und Aminolyse zu identifizieren. Abbildung 6 zeigt die Ergebnisse der reinen und modifizierten Proben. Kurz gesagt, während der Hydrolysebehandlung greifen Hydroxidionen, die beim Auflösen der NaOH-Verbindung im Wasser entstehen, die Carbonylgruppe des PCL an. Anschließend werden Hydroxyl- und Carboxylendgruppen gebildet, wie in Abb. 1 dargestellt50,51. Darüber hinaus bricht bei einer ähnlichen Reaktion bei der Aminolyse ein Diaminmolekül die Esterbindung im PCL und bindet sich daran, was zur Bildung von Amid- und Hydroxylgruppen führt50,51,52. Im Fall von PCL wurde festgestellt, dass alle Biege- und Streckschwingungen gut mit den gemeldeten Werten übereinstimmen; Dementsprechend liegen die charakteristischen Peaks bei 1720 cm−1 und 2943 cm−1, was auf Carbonylgruppen (C=O) bzw. C–H-Gruppen zurückzuführen ist. Obwohl das Auftreten des Amid-II-Peaks (–NH) bei 1560 cm–1 und des Hydroxyl-Peaks (–OH) bei ca. 3200 cm–1 für aminolysierte Proben und der Hydroxylgruppe bei ca. 3200 cm–1 für hydrolysierte Proben erwartet wurde, ergaben sich keine Änderungen in den Spektren wurde im Vergleich zum reinen PCL39,49,53,54 beobachtet. Dies kann auf die unzureichende Menge an funktionellen Amid- und Hydroylgruppen zurückzuführen sein, die vom ATR-FTIR-Instrument erfasst werden können (Tiefe ~ 1–2 µm)49,53,55.

FTIR-Spektren der Vertreter von (A) hydrolysierten PCL-Nanofaserproben und (B) aminolysierten Nanofaserproben.

Die thermische Analyse wurde durchgeführt, um die thermische Stabilität und das Zersetzungsverhalten von PCL und modifizierten Nanofasern zu bewerten. Abbildung 7A–C zeigt die Ergebnisse von TGA und DTGA von PCL als anständige Probe, S5- und S18-Proben als Klangproben. Generell ist bekannt, dass PCL aus einer einstufigen Zersetzung mit einer maximalen Zersetzungstemperatur (Tmax) von etwa 400 °C besteht. Wie in der Abbildung zu sehen ist, wiesen alle Proben (PCL, S5 und S18) eine einstufige Zersetzung mit einem anfänglichen Gewichtsverlust von 1–5 % auf, der auf die Entfernung von Restfeuchtigkeit zurückzuführen ist. Darüber hinaus begannen sich alle Proben aufgrund der Pyrolyse von Polyesterketten bei etwa 360 °C zu zersetzen und setzten sich bis zum maximalen Zerfall bei Tmax von 397 °C, 394 °C und 407 °C fort, der für PCL-, S5- und S18-Proben gilt Befehl. Diesen Ergebnissen zufolge verschlechterten Oberflächenmodifikationen das thermische Verhalten von Proben nicht, was früheren Studien folgt53,56.

(A) TGA-Thermogramme, (B) DTGA-Thermogramme, (C) Tabelle der Zersetzungsparameter und (D) XRD-Muster von PCL, hydrolysiertem PCL (S5) und aminolysiertem PCL (S18).

Die kristalline Beschaffenheit von PCL-, S5- und S18-Proben wurde mittels XRD-Analyse untersucht und die Ergebnisse sind in Abb. 7D dargestellt. Insgesamt lässt sich die Kristallinität von PCL an zwei Beugungspeaks erkennen, die mit den (110)- und (200)-Ebenen der orthorhombischen Kristallstruktur von PCL zusammenhängen und bei Bragg-Winkeln von 2θ = 23,6° und 21,3°57 beobachtet werden konnten ,58. Laut XRD-Diagramm haben Hydrolyse und Aminolysebehandlung keinen Einfluss auf die teilkristalline Struktur von PCL. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der früheren Literatur59.

Die XRD-Ergebnisse sowie die TGA- und FTIR-Ergebnisse deuten darauf hin, dass Hydrolyse und Aminolyse keinen Einfluss auf die Masse der PCL-Nanofasern haben. Die XRD-, TGA- und FTIR-Ergebnisse von hydrolysiertem und aminolysiertem PCL zeigten keinen merklichen Unterschied im Vergleich zu reinem PCL. Daher sind die Veränderungen in der Morphologie, den mechanischen Eigenschaften und der Hydrophilie von Nanofasern das Ergebnis einer Oberflächenmodifikation.

Zur Bestimmung der Elementmenge in PCL und modifizierten Proben wurde energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDAX) eingesetzt. Bei dieser Analyse wurden Elementzusammensetzungen einschließlich Kohlenstoff (C), Sauerstoff (O) und Stickstoff (N) gemessen und in Tabelle 1 aufgeführt. PCL enthält eine bestimmte Menge an Elementen, die sich unter verschiedenen Bedingungen ändern können. Daher könnte die Hydrolyse- und Aminolysebehandlung die Art und Menge der Elemente auf der PCL-Oberfläche verändern. Wie in Tabelle 1 gezeigt, lässt sich durch Erhöhen der Behandlungsdauer und der Konzentration sowohl der Hydrolyse- als auch der Aminolyselösungen ein absteigender Trend beim C-Prozentsatz und ein steigender Trend beim O-Prozentsatz beobachten. Diese könnten die Bildung funktioneller Gruppen auf der Oberfläche von PCL-Nanofasern nachweisen. Darüber hinaus erhöhte sich nach der Aminolyse die N-Menge aufgrund der Amidbindung auf der Oberfläche des PCL37,60.

Die Lebensfähigkeit von L929-Fibroblastenzellen auf den hergestellten PCL-Nanofasern wurde mithilfe des MTT-Assays bewertet. Das Balkendiagramm der Lebensfähigkeit ist in Abb. 8 dargestellt. Dementsprechend wurden die L929-Zellen auf den PCL- und modifizierten Proben kultiviert, um die Zytokompatibilität und Zytotoxizität zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die Proliferation der Zellen auf der PCL-Nanofaser zu jedem Zeitpunkt (1, 3 und 5 Tage) geringer war als in der Kontrollgruppe (Zellkulturplatte). Es ist zu beachten, dass die Lebensfähigkeit der Kontrollgruppe als 100 % angesehen wurde und die Behandlungsgruppen damit verglichen wurden. Andererseits induzierten die Oberflächenbehandlungen proliferative Effekte und machten PCL-Nanofasern für die Zellproliferation günstiger. Im Vergleich zu PCL zeigten die S5-, S9-, S14- und S18-Proben in allen Kulturzeiten eine signifikant höhere Lebensfähigkeit der Zellen (p < 0,05). Zu jedem Zeitpunkt gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den S5-, S9-, S14- und S18-Proben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine moderate Hydrolyse und Aminolyse (Probe S5 bzw. S14) ausreichen, um die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen auf dem PCL-Nanofasergerüst zu verbessern. Eine Erhöhung der Konzentration der Behandlungslösungen und der Behandlungsdauer führte nicht zu einer Steigerung der Zellproliferation.

(A) REM-Aufnahmen der L929-Fibroblasten, die auf PCL-basierten Nanofaserproben kultiviert wurden; (a) PCL, (b) S1, (c) S5, (d) S9, (e) S10, (f) S14, (g) S18. (B) Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit (relative Proliferation) der kultivierten L929-Zellen auf makellosem PCL, hydrolysierten Proben (S1, S5, S9) und aminolysierten Proben (S10, S14, S18) nach 1, 3 und 5 Tagen. *Zeigt einen statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zur PCL-Stichprobe an (p < 0,05).

Die signifikante Zellproliferation in modifizierten Proben könnte auf sauerstoffhaltige und Aminogruppen auf der Oberfläche von Nanofasern durch den Modifizierungsprozess zurückzuführen sein61. Das Vorhandensein funktioneller Gruppen auf den PCL-Nanofasern verbesserte nicht nur die Hydrophilie, sondern stellte auch aktive Stellen für die Adsorption von Biomolekülen, die Zellanhaftung und anschließend für eine verstärkte Zellproliferation bereit. Das beobachtete Zellproliferationsmuster stimmt mit früheren Studien überein. Zhu et al. berichteten, dass die Aminolyse von PCL-Nanofasern die Immobilisierung von Biomakromolekülen und die Zellproliferation förderte34. In einer anderen Studie haben Mattanavee et al. bestätigte die Wirksamkeit der eingeführten Amingruppe bei der Immobilisierung von Biomolekülen auf der Oberfläche des PCL-Gerüsts62.

Rasterelektronenmikroskopie (REM, TESCAN-Vega3, Tschechische Republik) wurde verwendet, um die Morphologie der anhaftenden Fibroblastenzellen auf den PCL-Nanofasern zu beurteilen. Generell besteht ein enger Zusammenhang zwischen Hydrophilie und der Form adhärenter Zellen63. Neben der Oberflächenbenetzbarkeit spielt die Art der Zellen eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf die Gerüste. L929-Fibroblasten neigen dazu, sich eher auf einer rauen als auf einer glatten Oberfläche auszubreiten64. Der gleichmäßige Durchmesser der PCL-Nanofasern spricht jedoch für ein geeignetes Gerüst für die Zellproliferation, die hydrophobe Oberfläche von PCL ist jedoch nicht günstig für die Zellanhaftung und -ausbreitung65. Daher ist die chemische Behandlung eine effiziente Möglichkeit, eine äußerst wünschenswerte Oberfläche für die Zellinteraktion vorzubereiten, indem ideale Oberflächenfunktionsgruppen (–OH, –COOH, –NH2) induziert werden. Wie in Abb. 8A gezeigt, weisen die Fibroblastenzellen auf dem PCL eine Kugelform auf, was auf die hydrophobe Natur des PCL zurückzuführen sein kann. Im Gegensatz dazu war die Morphologie der Zellen auf den oberflächenmodifizierten PCL-Nanofasern spindelförmig, was darauf hindeutet, dass die Zellen auf den modifizierten Nanofasern ihre native Morphologie aufwiesen. Darüber hinaus dehnen sich die Fibroblastenzellen bei Hydrolyse- und Aminolysebehandlungen mit zunehmender Zeit und Konzentration stark aus, was das Vorhandensein funktionellerer Gruppen betrifft. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass beide Oberflächenbehandlungen die Oberfläche der Nanofasern für die Zellanhaftung und -anpassung begünstigten, was mit den SEM-, WCA- und EDAX-Ergebnissen übereinstimmt.

Der Lebend/Tot-Assay ist eine Analysemethode zur Beobachtung lebensfähiger und toter Zellen und ihrer teilweisen Morphologie basierend auf der Fluoreszenzfärbetechnik. Die Abbildungen 9, 10 und 11 zeigen lebende Zellen auf dem PCL und modifizierten Nanofasern zu unterschiedlichen Zeitpunkten (1, 3 und 5 Tage). Basierend auf qualitativen und visuellen Beobachtungen war die Dichte lebender Zellen auf dem PCL aufgrund der Hydrophobie des PCL nach 5 Tagen unbestreitbar geringer als bei modifizierten Proben. Darüber hinaus ist die Erhöhung der Zellzahl in modifizierten Proben mit dem Vorhandensein einer großen Anzahl funktioneller Gruppen auf ihnen verbunden33,40. Darüber hinaus zeigten die auf den behandelten PCL-Nanofasern kultivierten Zellen eine spindelförmige und ausgedehnte Morphologie, die den REM-Bildern entsprach. Insgesamt überwiegen die positiven Auswirkungen chemischer Behandlungen ihre schädlichen Auswirkungen.

Fluoreszenzbilder der L929-Fibroblastenzellen, die am ersten Tag nach der Kultur auf den Proben kultiviert wurden; (a) PCL, (b) S1, (c) S5, (d) S9, (e) S10, (f) S14, (g) S18.

Fluoreszenzbilder der L929-Fibroblastenzellen, die am Tag 3 nach der Kultur auf den Proben kultiviert wurden; (a) PCL, (b) S1, (c) S5, (d) S9, (e) S10, (f) S14, (g) S18.

Fluoreszenzbilder der L929-Fibroblastenzellen, die am Tag 5 nach der Kultur auf den Proben kultiviert wurden; (a) PCL, (b) S1, (c) S5, (d) S9, (e) S10, (f) S14, (g) S18.

In der aktuellen Studie wurde eine Oberflächenmodifikation von PCL-Nanofasern durch Hydrolyse- und Aminolysebehandlungsverfahren durchgeführt, um eine bessere Plattform für Tissue-Engineering-Anwendungen zu entwickeln. Um einen umfassenden Einblick in den Einfluss chemischer Behandlungen zu erhalten, wurden die unberührte PCL-Probe und die oberflächenmodifizierten Proben gründlich charakterisiert und verglichen. Den Charakterisierungsergebnissen zufolge verändern sowohl Aminolyse als auch Hydrolyse hauptsächlich die Oberflächeneigenschaften von PCL-Nanofasern, ohne negative Auswirkungen auf ihre Masseneigenschaften. Genauer gesagt führten chemische Behandlungen in den schweren Fällen zu geringfügigen morphologischen Veränderungen und einer moderaten Verschlechterung der mechanischen Leistung. Bei den meisten Proben war jedoch ein spürbarer Anstieg der Hydrophilie der PCL-Nanofasermatten erkennbar. Offensichtlich führen eine höhere Konzentration der Hydrolyselösung und eine längere Inkubationszeit zu einer besseren Verbesserung der Hydrophilie auf Kosten einer relativen Schwächung der Masse. Bei aminolysierten Proben war dieser Trend jedoch weniger deutlich. Ungeachtet dessen waren die mikrostrukturellen Merkmale und die mechanische Leistung der ausgewählten Proben für einige Tissue-Engineering-Anwendungen akzeptabel.

Die erhaltenen Ergebnisse aus In-vitro-Studien zeigten, dass die Oberflächenmodifikationen von PCL-Nanofasern nicht nur eine zytotoxische Wirkung hervorrufen, sondern auch eine ideale Oberfläche für die Zellanheftung, -ausbreitung und -proliferation bieten. Die kultivierten L929-Zellen zeigten hauptsächlich ihre native fibroblastische Morphologie auf den behandelten Proben mit mehreren Interaktionsstellen mit den hydrolysierten und aminolysierten PCL-Nanofasern. Diesen Erkenntnissen zufolge könnten die hydrolysierten und aminolysierten PCL-Nanofasermembranen unter bestimmten Bedingungen als potenzielle Kandidaten für Gerüste für die Gewebezüchtung dienen.

PCL (Mw = 80.000 g mol−1), NaOH und NaCl wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA) bezogen. Chloroform, N,N-Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Isopropanol wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. MTT-Pulver wurde von Sigma Aldrich (Darmstadt, Deutschland) erworben. DMEM/F-12-Zellkulturmedium, fötales Rinderserum (FBS), Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) und Trypsin-EDTA wurden von Gibco (Thermo Fisher Scientific, Dreieich, Deutschland) bezogen.

PCL-Nanofasern wurden unter Verwendung eines kommerziellen Elektrospinngeräts (Fanavaran Nano Meghyas Ltd., Co., Teheran, Iran) hergestellt. Eine geeignete Menge PCL wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus DMF/Chloroform (50/50) gelöst, um eine Endkonzentration von 14 Gew.-% zu erhalten. Die Polymerlösung wurde 16 Stunden lang auf einem Magnetrührer gerührt, um eine klare und homogene Lösung zu erhalten. Die erhaltene Lösung wurde in eine 5-ml-Spritze gefüllt, die mit einer stumpfen 20-Gauge-Nadel ausgestattet war. Die Zufuhrgeschwindigkeit, die angelegte Spannung und der Abstand zwischen Düse und Kollektor wurden auf 1,5 ml/h, 10 kV bzw. 140 mm eingestellt, um die Nanofasermatte auf dem mit Aluminiumfolie bedeckten Kollektor zu sammeln. Die erhaltenen elektrogesponnenen PCL-Matten wurden für Verfahren zur Oberflächenmodifizierung und weitere Charakterisierungen vorbereitet, wie in Abb. 12 kurz dargestellt.

Ein Überblick über den Herstellungsprozess, chemische Behandlungsverfahren, Charakterisierungen und In-vitro-Studien.

Hydrolyse- und Aminolyseverfahren wurden durchgeführt, um sauerstoffhaltige und Aminogruppen auf der Oberfläche elektrogesponnener PCL-Nanofasern einzuführen. Die Hydrolyse wurde mit NaOH-Lösung in den Konzentrationen 0,5, 1 und 2 M und drei Inkubationszeitpunkten durchgeführt; 1, 6 und 12 Stunden. Zu jedem Inkubationszeitpunkt wurden die behandelten Proben aus der Behandlungslösung entnommen, mehrmals mit entionisiertem (DI) Wasser gewaschen und über Nacht in DI-Wasser inkubiert, um nicht reagiertes NaOH zu entfernen. Anschließend wurden die Proben 5 Stunden lang bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend über Nacht unter Vakuum bei 30 °C getrocknet.

Der Aminolyseprozess wurde unter Verwendung von Hexamethylendiamin (HMD)/Isopropanol (IPA)-Lösungen durchgeführt, die in Konzentrationen von 0,5, 1 und 2 M hergestellt wurden. Die nanofaserigen Proben wurden 1, 12 und 20 Minuten lang in die Aminolyselösung getaucht und inkubiert 24 h bei 37 °C. Nach Erreichen des Inkubationszeitpunkts wurden die Proben aus der Behandlungslösung entfernt, mehrmals mit entionisiertem Wasser gewaschen und über Nacht in entionisiertem Wasser inkubiert, um das restliche HMD von der Oberfläche zu entfernen. Anschließend wurden die Proben 5 Stunden lang bei Raumtemperatur getrocknet und über Nacht in einen Vakuumtrockner bei 30 °C gestellt. Tabelle 2 gibt einen detaillierten Überblick über die Probenvorbereitung.

Die strukturellen Eigenschaften von Nanofasermatten und die Morphologie der Nanofasern wurden mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop QUANTA FEG 450 (FEI, USA) bewertet. Zur Vorbereitung der Proben wurden die Matten gestanzt, mit einer dünnen Schicht (8 nm) Gold (DST3, Iran) aufgesputtert und bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV mikroskopiert. Der Durchmesser der PCL-Nanofasern wurde mit der Image J-Software (1,47 V, National Institute of Health, USA) gemessen und durch Mittelung von mindestens 100 einzelnen Nanofasern für jede Probe angegeben.

Elementaranalysen der PCL-basierten Proben wurden mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie (EDS) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein energiedispersives Röntgenspektroskop Octane Elite (Gatan Inc., USA) verwendet, das mit dem FESEM-Gerät gekoppelt wurde. Die relativen Prozentsätze von Kohlenstoff (C), Sauerstoff (O) und Stickstoff (N) wurden in allen Proben analysiert und in Tabelle 1 angegeben.

Die Benetzbarkeit von so vorbereiteten PCL-basierten Proben wurde mit einem statischen Kontaktwinkelmessgerät (IRASOL/CA-500A, Iran) bei Umgebungstemperatur untersucht. Der Prozess der Absorption des Wassertropfens wurde von einer Rahmenkamera aufgezeichnet, die in der Lage war, Hochgeschwindigkeitsereignisse zu erfassen. Anschließend wurden die Kontaktwinkelmessungen zwischen den Wassertropfen und der Probenoberfläche anhand der erfassten Bilder (in Sekunde 5) mit der entsprechenden Software analysiert.

Die möglichen Veränderungen in den Oberflächenfunktionsgruppen von Proben wurden mit einem Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infra-Red (ATR-FTIR)-Spektrometer (Tensor II/Bruker, Deutschland) untersucht. Die Analysen wurden im Transmissionsmodus im Wellenzahlbereich von 4000–400 cm−1 und mit einer spektralen Auflösung von 2 cm−1 durchgeführt. Für jede Probe wurden die aufgezeichneten Daten aus den 32 Scans erfasst.

Die thermogravimetrische Analyse (TGA) der Proben wurde mit einem thermogravimetrischen Analysegerät Q600 (TA Instruments, USA) durchgeführt. Ungefähr 10 mg der Proben wurden abgewogen und in eine Aluminiumpfanne gegeben, um unter einer Inertatmosphäre (Argongas) mit einer Heizrate von 10 °C min−1 von 24 auf 600 °C erhitzt zu werden. Zur Darstellung der abgeleiteten Thermogramme der Proben wurde die Software Origin Pro 9.1 (Originlab Corporation, Northampton, MA, USA) verwendet.

Die Kristallinität der PCL-basierten Proben wurde mit der Röntgenbeugungstechnik (XRD) bewertet. Diese Charakterisierung wurde mit einem Xpert-Gerät (Philips, Niederlande) durchgeführt. Monochromatische CuKα-Strahlung (λ = 1,54056 Å), erzeugt bei einer Spannung und einem Strom von 40 kV bzw. 40 mA, wurde angewendet, um die Diffraktogramme in einer Schrittgröße von 0,08° s−1 und einem 2θ-Bereich von 10°–80° zu sammeln.

Das mechanische Verhalten der elektrogesponnenen PCL-Proben wurde mit einem einachsigen Zugprüfgerät (Santam, Karaj, Iran) bewertet. Vor dem Test wurden die Nanofasermatten in rechteckige Streifen von 40 mm × 10 mm geschnitten und ihre Dicke mit einem Mikrometer genau gemessen. Die so vorbereiteten Proben wurden zwischen den Innenseiten der Spannvorrichtungen platziert und fixiert, von den Probenhaltern abgedeckt und mit einer Traversengeschwindigkeit von 5 mm/min bis zum mechanischen Versagen gezogen. Der Test wurde für jede Probe fünfmal durchgeführt und die Daten wurden als Mittelwert ± SD angegeben.

Die Lebensfähigkeit und Proliferation kultivierter Zellen auf der Oberfläche von PCL-basierten Proben wurden mithilfe der MTT-Assay-Auswertungen untersucht (n = 5). Die Nanofasermatten wurden in kugelförmige Stücke (6 mm Durchmesser) geschnitten, auf den Boden einer 96-Well-Platte gelegt, mit UV-Licht sterilisiert (30 Minuten lang), mit antibiotikahaltigem PBS (pH: 7,4) gewaschen und mit DMEM angereichert /F12-Zellkulturmedium. Die Anzahl der kultivierten L929-Zellen auf den PCL-basierten Proben betrug 2,5 × 104, 1,5 × 104 und 0,5 × 104 für die Zeitpunkte 24, 72 bzw. 120 Stunden. Bei Erreichen jedes Zeitpunkts wurden mehrere PBS-Waschschritte vorsichtig durchgeführt und anschließend das überstehende Kulturmedium durch die MTT-Lösung (100 µl, 0,25 mg ml−1) ersetzt. Die MTT-Lösung wurde auf den Proben 4 Stunden lang bei 37 °C und einer Atmosphäre mit 5,0 % CO2 inkubiert. Anschließend wurde die MTT-Lösung entfernt und durch 100 µl DMSO ersetzt. Die Platte wurde in Folie eingewickelt und 20 Minuten lang auf eine Schüttelmaschine gestellt, um die Formazankristalle aufzulösen. Anschließend wurde ein Mikroplatten-Spektrophotometer (Epoch, USA) verwendet, um die Intensität der Absorption bei 570 nm zu analysieren.

Die Anheftung, Ausbreitung und Morphologie kultivierter L929-Zellen auf den PCL-basierten Proben wurden mithilfe von Live/Dead- und SEM-Zelladhäsionstests untersucht. Vor dem Lebend-/Tot-Assay wurden fünf Proben jeder ausgewählten Probe in quadratische Stücke (1 × 1 cm) geschnitten und für die Studie vorbereitet. Genauer gesagt wurden die Proben unter UV-Licht sterilisiert (30 min), separat auf den Boden der Plattenvertiefungen gelegt und mehrmals mit antibiotikahaltigem PBS (pH: 7,4) sowie Zellkulturmedium gewaschen. Der Test wurde zu den drei Zeitpunkten 24, 72 und 120 Uhr durchgeführt. Nach Erreichen eines bestimmten Zeitpunkts wurde das überstehende Zellkulturmedium durch das frisch zubereitete Färbemedium, bestehend aus Propidiumiodid (PI) und Fluoresceindiacetat (FDA), ersetzt und 10 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden die gefärbten Proben dreimal vorsichtig mit PBS (pH: 7,4) gewaschen und die Anhaftung, Ausbreitung und Morphologie der Zellen wurden unter Verwendung eines inversen Fluoreszenzmikroskops IX71 (Olympus, Japan) beobachtet. Die grün und rot gefärbten Zellen in den mikroskopischen Aufnahmen waren Hinweise auf lebende bzw. tote Zellen.

Die Ausbreitungsmorphologie, die Zell-Nanofaser-Wechselwirkungen und die mögliche Infiltration der L929-Zellen wurden durch den SEM-Zelladhäsionstest untersucht. Für diesen Test wurden ausgewählte Proben gemäß der für den Lebend/Tot-Assay erläuterten Methode vorbereitet. Diese Studie wurde jedoch lediglich zu dem Zeitpunkt durchgeführt, der optimal schien (72 Stunden). Bei Erreichen des Zeitpunkts wurde das überstehende Kulturmedium entfernt und die Proben wurden zweimal sanft mit PBS (pH: 7,4) gewaschen. Anschließend wurden die Proben mit der Fixierungslösung (Glutaraldehyd 2,5 % in PBS) 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Das Fixiermittel wurde dann entfernt und die Proben wurden dreimal mit PBS (pH: 7,4) gewaschen, um alle verbleibenden Glutaraldehydrückstände zu entfernen. Anschließend wurden die Proben in einem Gradienten von Ethanollösungen (30, 50, 70, 90 und 100 %) dehydriert. Die vorbereiteten Proben wurden mit einer dünnen Goldschicht (8 nm) durch Sputtern beschichtet und mittels Feldemissionsmikroskopie bei einer Beschleunigungsspannung von 20 kV untersucht.

Zur Bewertung der statistischen Signifikanz der Daten wurden die einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und Tukeys Mehrfachvergleichstests des SPSS-Programms, Version 23 (IBM, Armonk, NY, USA) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor, Dr. Esmaeil Mirzaei, erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der Shiraz University of Medical Sciences finanziert (Grant-Nr. 20388).

Abteilung für medizinische Nanotechnologie, School of Advanced Medical Sciences and Technologies, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran

Raziye Yaseri, Milad Fadaie und Esmaeil Mirzaei

Forschungszentrum für Nanomedizin und Nanobiologie, Medizinische Universität Shiraz, Shiraz, Iran

Esmaeil Mirzaei

Abteilung für Tissue Engineering, School of Advanced Technologies in Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran

Hadi Samadian

Biotechnologisches Forschungszentrum, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran

Alireza Ebrahiminezhad

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RY führte alle Experimente durch, bereitete die Ergebnisse vor und schrieb das Manuskript. MF beteiligte sich an der Durchführung einiger Experimente, bereitete und analysierte die Ergebnisse und trug zum Verfassen des Manuskripts bei. Dr. EM ist für die Grundidee der Arbeit verantwortlich, hat die Studie entworfen und das Manuskript überarbeitet. Dr. A. E analysierte die Ergebnisse und überarbeitete die Daten. Dr. H. S. trug zum Schreiben des Manuskripts und zur Datenanalyse bei. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Esmaeil Mirzaei oder Alireza Ebrahiminezhad.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yaseri, R., Fadaie, M., Mirzaei, E. et al. Oberflächenmodifikation von Polycaprolacton-Nanofasern durch Hydrolyse und Aminolyse: eine vergleichende Studie zu strukturellen Eigenschaften, mechanischen Eigenschaften und zellulärer Leistung. Sci Rep 13, 9434 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36563-w

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Eingegangen: 12. Februar 2023

Angenommen: 06. Juni 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36563-w

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