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Aug 26, 2023

Strukturanalyse und Architekturprinzipien der bakteriellen Amyloid-Curli

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2822 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Zwei Jahrzehnte sind seit der ursprünglichen Annahme vergangen, dass Amyloide nicht nur (toxische) Nebenprodukte einer unbeabsichtigten Aggregationskaskade sind, sondern dass sie auch von einem Organismus produziert werden können, um eine definierte biologische Funktion zu erfüllen. Diese revolutionäre Idee entstand aus der Erkenntnis, dass ein großer Teil der extrazellulären Matrix, die gramnegative Zellen in einem beständigen Biofilm hält, aus Proteinfasern (Curli; Tafi) mit Kreuz-β-Architektur, keimbildungsabhängiger Polymerisationskinetik und klassischer Struktur besteht färbende Eigenschaften von Amyloid. Die Liste der Proteine, die nachweislich in vivo sogenannte funktionelle Amyloidfasern bilden, hat sich im Laufe der Jahre stark erweitert, detaillierte strukturelle Erkenntnisse folgten jedoch teilweise aufgrund der damit verbundenen experimentellen Hindernisse nicht in ähnlichem Tempo. Hier kombinieren wir umfangreiche AlphaFold2-Modellierung und Kryo-Elektronentransmissionsmikroskopie, um ein Atommodell von Curli-Protofibrillen und ihren höheren Organisationsmodi vorzuschlagen. Wir entdecken eine unerwartete strukturelle Vielfalt an Curli-Bausteinen und Fibrillenarchitekturen. Unsere Ergebnisse ermöglichen eine Rationalisierung der extremen physikalisch-chemischen Robustheit von Curli sowie frühere Beobachtungen der Promiskuität von Curli zwischen den Arten und sollten weitere technische Bemühungen zur Erweiterung des Repertoires an auf Curli basierenden Funktionsmaterialien erleichtern.

Obwohl früher als unplausibles Ziel für die Strukturbiologie angesehen, haben jüngste Entwicklungen in der Kryo-Elektronenmikroskopie (KryoEM) und der helikalen Verarbeitung die Strukturbestimmung von Amyloidfibrillen mit nahezu atomarer Auflösung erleichtert1. Eine Fülle experimentell ermittelter Strukturen sowohl in vitro erzeugter als auch ex vivo isolierter Amyloide hat eine verwirrende strukturelle Vielfalt von Faserarchitekturen offenbart, einschließlich des Konzepts von Faserpolymorphen oder Stämmen ansonsten identischer oder eng verwandter Sequenzen2,3,4,5. Trotz der Unterschiede in der Protofibrillenarchitektur und der helikalen Fasersymmetrie weisen die meisten Amyloidstrukturen mehrere konservierte Merkmale auf, die es uns ermöglichen, die Definition der Amyloidfalte über das traditionelle Cross-Beta-Sprichwort hinaus zu erweitern. Nach unserem besten Wissen bestehen alle derzeit beschriebenen Amyloidstrukturen aus einer sich wiederholenden Stapelung komplizierter, schlangenförmiger, planarer β-Strang-Anordnungen, die durch sterische Reißverschlussmotive stabilisiert werden, wobei ineinandergreifende Seitenkettenreste ausgedehnte Van-der-Waals-, elektrostatische, hydrophobe und Wasserstoff bildende Strukturen bilden Bondkontakte. Die axiale Stapelung planarer Peptide durch Strang-Strang-Andocken und β-Arkadenbildung treibt die Bildung von Protofibrillen voran, gefolgt von der helikalen Wicklung mehrerer Protofibrillen zu einer bemerkenswert stabilen helikalen Überstruktur. Genau diese helikale Symmetrie wurde mit großem Erfolg in modernen KryoEM-Ansätzen genutzt, um die strukturellen Details einer Vielzahl von Amyloidstrukturen aufzuklären.

Die meisten dieser Strukturen gehören zu einer Unterfamilie von Amyloidspezies, die mit einer Vielzahl von (neuro)degenerativen, systemischen Ablagerungs- und Fehlfaltungskrankheiten in Zusammenhang stehen. Aus diesem Grund werden diese amyloidogenen Proteine ​​umgangssprachlich auch als pathologische Amyloide (PAs) bezeichnet. Diesen krankheitsassoziierten Amyloiden ist gemeinsam, dass sie ein nicht-funktionales und außerhalb des Signalwegs liegendes Fehlfaltungs- und Aggregationsereignis von Proteinen oder Proteinfragmenten darstellen, die durch Mutation, Umweltbedingungen oder Fehlverarbeitung daran gehindert werden, ihre ursprüngliche Struktur zu erreichen. Es gibt einen zweiten Zweig der Amyloidfamilie, der in allen Bereichen des Lebens zu finden ist und aus Proteinen besteht, die sich entwickelt haben, um bestimmte biologische Rollen (wie Adhäsion, Speicherung, Gerüstbildung usw.) zu erfüllen, indem sie den Amyloidzustand annehmen – was diesen Proteinen das ermöglicht Begriff funktionelle Amyloide (FAs)6,7,8. Wie pathologische Amyloide zeigen FAs eine keimbildungsabhängige Aggregation zu Fasern mit Kreuz-β-Eigenschaften. Eine rätselhafte Frage ist, ob FA-Wege ausgewählte Merkmale umfassen, um den zytotoxischen Gewinn von Funktionseigenschaften, der so häufig mit pathologischen Amyloidablagerungen verbunden ist, abzuschwächen oder nicht. Für bakterielle Amyloidwege wie Curli und Fap ist klar, dass akzessorische Proteine ​​eine rechtzeitige und lokalisierte Amyloidablagerung gewährleisten, einschließlich chaperonähnlicher Schutzmaßnahmen, die eine vorzeitige Amyloidogenese verhindern oder stoppen9,10. Ob die Strukturen der FA-Untereinheiten und Fasern auch adaptive Merkmale umfassen, die die Zytotoxizität verringern, ist jedoch weit weniger bekannt. Interessanterweise gibt es Hinweise aus In-vitro-Experimenten, dass FAs, die von verschiedenen pathogenen Bakterien produziert werden, eine Kreuzreaktivität mit PAs11 aufweisen können, und Berichte über eine potenziell infektiöse Induktion oder Verschlimmerung pathologischer Amyloidablagerungen durch direkte Kreuzsaat oder indirekte (entzündliche) Wirkungen beim Menschen und Tiere, die bakteriellen Amyloiden ausgesetzt waren12,13. Da für FAs nur wenige Strukturen verfügbar sind14,15, ist zum jetzigen Zeitpunkt unklar, ob FAs strukturell mit PAs verwandt sind und ob sie einen separaten Zweig der Amyloidarchitekturen bilden. Es ist auch nicht klar, welcher molekulare Mechanismus für diese FA/PA-Amyloid-Promiskuität zwischen den Spezies verantwortlich sein könnte.

Die Amyloidfalte gilt als einer der stabilsten quartären Proteinzustände. Die vorprogrammierten Selbstorganisationseigenschaften von FAs haben gerade wegen ihrer extremen Robustheit und Fähigkeit, sich mit minimalem Eingriff oder katalytischer Unterstützung spontan zu entwickeln, allgemeines Interesse für ihre Verwendung in synthetischen Biologie- und Biotechnologieanwendungen geweckt. Obwohl einige Erfolge bei der Entwicklung fortschrittlicher, aus FAs abgeleiteter Funktionsmaterialien16,17 gemeldet wurden, liegt es auf der Hand, dass das Gebiet von einem tieferen Strukturverständnis profitieren wird, um eine Reihe rationaler Designprinzipien zu entwickeln. Angesichts der jüngsten Fortschritte im De-novo-Proteindesign glauben wir, dass dies dazu beitragen könnte, eine Ära der maßgeschneiderten Amyloidpolymerproduktion einzuläuten.

Um den strukturellen biologischen blinden Fleck in Bezug auf FAs zu beseitigen, haben wir die Struktur der bakteriellen Modell-FA-Curli untersucht. Curli-Fasern sind ein Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix gramnegativer Bakterien und werden unter Bedingungen der Biofilmbildung exprimiert, wo sie eine Gerüst- und Zementierungsfunktion im extrazellulären Milieu erfüllen, um die Bakteriengemeinschaft zu stärken18,19. Die Hauptuntereinheit von Escherichia coli curli ist das 13,1 kDa große Pseudo-Repeat-Protein CsgA, das als ungeordnetes Monomer sezerniert wird, das unter einer Vielzahl von Bedingungen gekreuzte β-Fasern mit klassischen amyloidfärbenden Eigenschaften bildet20. Im nativen Kontext erfordert die Bildung zellassoziierter CsgA-Fibrillen die kleine Curli-Untereinheit CsgB, die wiederum an den CsgG-CsgF-Sekretionsporenkomplex der Außenmembran gebunden ist21,22. Obwohl Strukturmodelle für ein gefaltetes CsgA-Monomer vorgeschlagen wurden, die auf Homologiemodellierung23, Festkörper-NMR24 und koevolutionärer Kopplungsanalyse25 basieren, ist keine experimentelle Curli-Struktur verfügbar. Hier präsentieren wir eine eingehende bioinformatische Studie des Amyloid-Curli-Kerns durch Analyse der Primärsequenzen eines lokalen CsgA-Katalogs, der durch umfassendes Mining der bakteriellen Refseq-Datenbank erstellt wurde. Basierend auf dieser Analyse schlagen wir verschiedene Strukturklassen von Curli-Untereinheiten vor und diskutieren die erwarteten Auswirkungen auf die CsgA-Faltung und damit auch auf die Curli-Faser-Architektur. Wir testen und validieren diese Vorhersagen auf der Grundlage einer umfassenden AlphaFold 2 (AF2)-Modellierung von über 2500 CsgA-Homologensequenzen. Als nächstes wählten wir zwei CsgA-Kandidaten für eine detaillierte KryoEM-Analyse aus, aus der wir Abstandsbeschränkungen und ein KryoEM-Volumen mittlerer Auflösung ableiten, die in hervorragender Übereinstimmung mit den vorgeschlagenen AF2-Modellen sind. Darauf aufbauend präsentieren wir ein molekulares Modell für eine CsgA-Protofibrille und diskutieren ihre Organisationsmodi höherer Ordnung in der extrazellulären Matrix und den in vitro gebildeten Fasern.

Zunächst richten wir eine lokale Datenbank homologer CsgA-Sequenzen ein, indem wir das Refseq-Bakteriengenom-Repository mithilfe der von Dueholm et al. erstellten HMM-Curli-Profile durchsuchen.19 Insbesondere für CsgA verwenden wir ein HMM-Profil, das spezifisch für die Amyloid-Wiederholung ist Daher wird nicht erwartet, dass zwischen der Haupt-Curlin-Untereinheit CsgA und der Neben-Curlin-Untereinheit und dem angeblichen Nukleator CsgB unterschieden wird. Im Folgenden werden wir diese Gruppe von Curli-Repeat-enthaltenden Proteinen als CsgA bezeichnen, wobei zu berücksichtigen ist, dass eine Subpopulation CsgB-Sequenzen entspricht. Ein Vergleich der CsgA- und validierten CsgB-Sequenzen erfolgt im letzten Absatz des Ergebnisabschnitts.

Von insgesamt 201210 durchsuchten Bakteriengenomen enthielten 43279 (22%) Genome eine oder mehrere vorhergesagte CsgA-Sequenzen, die eine oder mehrere Curli-Repeat-Signaturen enthielten (Abb. 1a). Dies korrelierte gut mit der Anwesenheit der anderen Gene im Curli-Operon. Aus den 43279 Genomen, die CsgA enthielten, haben wir CsgG, CsgF, CsgE und CsgC oder CsgH in 41041, 41597, 41090 und 37945 bzw. 1839 Genomen nachgewiesen. Nur einer kleinen Minderheit (1033; 2 %) der CsgA-haltigen Genome fehlte eine Kopie des Curli-Sekretionskanals CsgG. Diese geringe Anzahl von CsgA-Waisen zeigt in Kombination mit der hervorragenden Korrelation zum Vorhandensein der anderen Curli-Biogeneseproteine, dass der resultierende Datensatz von CsgA-Proteinsequenzen überwiegend von csgA/B-Genen stammt, die in ein Curli-Operon eingebettet sind. Die überwiegende Mehrheit (40559) dieser Genome enthält zwei CsgA-ähnliche Kopien, was wahrscheinlich der funktionellen Diversifizierung in CsgA und CsgB26 entspricht. Interessanterweise können Genome mit mehr als zwei CsgA-Homologen gefunden werden, wobei die Anzahl der CsgA-Kopien pro Genom exponentiell in Richtung 14 Kopien abnimmt und ein Maximum von 30 nachgewiesen wird (GCF_003076275.1_ASM307627v1) (Abb. 1a). Nach der Entfernung von Teileinträgen erhalten wir eine Liste von 87205 mutmaßlichen CsgA-Sequenzen, die sich durch Kürzung der Leadersequenzen und Entfernung von Duplikaten auf einen Datensatz von 8079 einzigartigen CsgA-ähnlichen Sequenzen reifer Domänen reduziert. Als ersten Proxy für die Anzahl der Curlin-Wiederholungen pro CsgA-Homolog verwenden wir die gemeldete Anzahl von Treffern für die Curlin-Wiederholung in der HMMER-Protokolldatei. Dies ergibt eine Verteilung von CsgA-Homologen mit Wiederholungszahlen, die das Spektrum von 4 bis 62 abdecken (WP_189563214.1), mit lokalen Maxima bei 5 oder 7–8 Curlin-Wiederholungen (die ersteren sind typisch für Enterobakterien wie Escherichia und Salmonella) und sekundären Maxima etwa 15 und 22 (Abb. 1b). Durch Auftragen der Anzahl der vorhergesagten Wiederholungen gegen die Länge der Primärsequenz ergibt sich, dass die durchschnittliche Länge einer Curlin-Wiederholung 23 ± 5 beträgt (Abb. 1b Einschub). Die geringe Standardabweichung zeigt, dass die durchschnittliche Länge einer einzelnen Curlin-Wiederholung für CsgA stark konserviert ist und folglich auch die lateralen Abmessungen der resultierenden Fasern (siehe unten).

a Verteilung der Anzahl der pro Genom nachgewiesenen csga-Homologen; b Verteilung der Anzahl der vorhergesagten Curlin-Wiederholungen. Einschub: Anzahl der Curlin-Wiederholungen pro Proteinlänge, mit einer Steigung von n = 23 ± 5 aa; c Konsenssequenz einer Curlin-Wiederholung mit dem darunter angegebenen vorgeschlagenen Curlin-Motiv; d Achsenansicht einer β-Solenoidfalte mit hervorgehobenen konservierten, nach innen gerichteten Resten; e Repräsentative Primärsequenzen (Seq-ID in Klammern) von drei Sequenzklassen von CsgA, gestapelt gemäß ihren vorhergesagten Curlin-Wiederholungen, mit den jeweiligen unten angegebenen Konsensusmotiven (rot und blau für Motiv a bzw. B gefärbt, grün bei Abweichung).

Die große Variation der CsgA-Wiederholungszahlen verhindert die Untersuchung der Sequenzkonservierung und -variabilität im Amyloidkern durch globales Sequenzalignment. Vielmehr haben wir 53574 nicht überlappende, lineare Segmente von 24aa extrahiert, die auf einem QX10Q-Motiv (und Permutationen davon) zentriert sind, das den prototypischen Amyloidkern der CsgA-Curlin-Wiederholungen darstellt. Daraus leiten wir eine Konsensussequenz27 ab, die eine bemerkenswerte Konservierung an Schlüsselstellen aufweist und zeigt, dass Curlin-Wiederholungen in eng verwandte Motive a und b unterteilt werden können, typischerweise getrennt durch eine 4-Reste-Sequenz mit XGXX-Signatur, wobei X eine beliebige Aminosäure ist (Abb. 1c). In der vorhergesagten CsgA-Struktur (siehe unten) bilden diese Curlin-Wiederholungselemente die Stränge 1 und 2 und die Verbindungsschleife oder den β-Bogen eines β-Bogens, wie von Henetin et al.28 definiert. Daher sind die Reste unten in Rot und Blau angegeben Das Sequenzlogo27 (Abb. 1c) und die Strukturdarstellung (Abb. 1d) sind auf die nach innen gerichteten Reste des sterischen Reißverschlusses abgebildet, während die schwarz markierten Reste (Abb. 1c) auf die nach außen gerichteten Oberflächenreste des Strang-Bogen-Strangs abgebildet sind (d. h. β-Bogen)-Motiv, das eine einzelne Curlin-Wiederholung darstellt. Die Basissignatur der Motive a und b besteht aus N-$-Ψ1-$-Ψ2-$-Q, wobei Ψn hydrophobe Reste (A,I,V,L,F), S oder T sind und zur Innenseite von zeigen der β-Bogen, zusammen mit einem gut konservierten N am Anfang und Q am Ende der Motive. Rückstände an Stellen, die $ entsprechen, liegen an der Oberfläche frei und sind überwiegend polar oder geladen (T, S, D, E, Q, N, R, Y), was darauf hindeutet, dass die meisten Curli-Fasern voraussichtlich hydrophil sind. Auf Motiv b folgen 4–5 Reste, am typischsten in einem XGXX-(X)-Motiv. Diese Schleifenregion bildet einen zweiten β-Bogen, der Motiv b mit Motiv a in der nachfolgenden Curlin-Wiederholung verbindet (Abb. 1d).

Bei der detaillierteren Analyse der Curli-Untereinheiten identifizieren wir drei Sequenzklassen: zentrosymmetrisch (CS), nicht zentrosymmetrisch (NCS) und degeneriert (D) (Abb. 1e). Die CS-Klasse enthält Curlin-Wiederholungssequenzen, für die die zum Kern gerichteten Reste im Motiv a (dh N, Ψ1, Ψ2 und Q an den Positionen 1, 3, 5 bzw. 7) eine (nahezu) identische Wiederholung im Motiv bilden b (dh Positionen 12, 14, 16 und 18), wobei A0A0E3UX01 von Pontibacter korlensis als repräsentatives Beispiel dient (Abb. 1e). Unter Berücksichtigung der erwarteten Tertiärstruktur (Abb. 1d) ergibt sich ein sterischer Reißverschluss, der hinsichtlich der Platzierung der zum Kern weisenden Reste zentrosymmetrisch ist. Bemerkenswerterweise halten sich nach außen gerichtete Reste (z. B. $) nicht an den selektiven Druck, der die Zentrosymmetrie beibehält, die in den Curlin-Wiederholungen von CsgA-Sequenzen der CS-Klasse beobachtet wird. CsgA-Sequenzen der NCS-Klasse bestehen aus Curlin-Wiederholungen, bei denen die zum Kern gerichteten Reste in den Motiven a und b keine (nahezu) perfekten Wiederholungen sind, was zu sterischen Reißverschlüssen führt, die nicht zentrosymmetrisch sind, wie dies bei CsgA aus E. coli der Fall ist oder Salmonella enterica (Abb. 1e). In EcCsgA ist N in Motiv a durch S ersetzt, und die Positionen Ψ1, Ψ2 sind sperrige Hydrophobe (I, L, M), im Gegensatz zu überwiegend kleinen Hydrophoben (A, V) in Motiv b. Es kann eine dritte Klasse von CsgA-Sequenzen unterschieden werden, die degenerierte Wiederholungen aufweisen, d. h. Wiederholungen, bei denen entweder Motiv a und/oder b unvollständig ist (z. B. Fehlen des flankierenden N in Motiv a oder Q in Motiv b) und/oder wo Curlin-Wiederholungen sind aufgrund von Insertionen stromabwärts von Motiv a (dh Bogen 1) oder Motiv b (dh Bogen 2) erheblich länger als die durchschnittlichen 23 Reste, wobei A0A0S1S4K2 von Sediminicola sp. YIK13 als repräsentatives Beispiel. Seltener können Einfügungen jedoch auch in Motiv a oder b fallen, wobei A0A0T5PAS6 von Roseovarius indicus ein repräsentatives Beispiel ist (Abb. 1e).

Schließlich zeigt unsere Sequenzanalyse, dass CsgA-Sequenzen in einer vollständigen oder halben Curlin-Wiederholung enden können, dh in einer prototypischen Motiv-A-Bogen-Motiv-B-Sequenz oder nur in einer Motiv-A-Sequenz (Abb. 1e). Da Motiv a und b Strang 1 und 2 der Curlin-β-Bögen darstellen, kann davon ausgegangen werden, dass der Abschluss in einem vollständigen oder unvollständigen β-Bogen die Kontakte zwischen den Untereinheiten in den resultierenden Fasern beeinflusst (siehe unten). Bemerkenswert ist außerdem, dass CsgA-Sequenzen mit einer einzelnen degenerierten Curlin-Wiederholung beginnen können, bei der die flankierenden N(S) und Q-Motive a und b häufig zu G mutiert sind, wobei EcCsgA (Abb. 1e) ein repräsentatives Beispiel ist. Im Fall von EcCsgA ist diese degenerierte N-terminale Wiederholung als N22 bekannt und stellt eine Targeting-Sequenz dar, die den CsgG-Sekretionskanal bindet und von der festgestellt wurde, dass sie nicht in den Amyloidkern der Curli-Faser eingebaut wird20,29. Bemerkenswert ist, dass unsere Sequenzanalyse darauf hinweist, dass das Vorhandensein einer N22-ähnlichen Sequenz eher ein Ausreißer als die Regel ist. Im folgenden Abschnitt diskutieren wir zunächst die vorhergesagten Tertiärstrukturen für CsgA-Sequenzen der CS-, NCS- und D-Klasse und die strukturellen Implikationen für das gefaltete CsgA-Monomer. Beachten Sie, dass wir uns hier auf eine strukturelle Klassifizierung von Curlin-Motiven und Untereinheiten konzentrieren. Für eine phylogenetische Analyse verweisen wir die Leser auf frühere Arbeiten von Dueholm et al.19

Wir verwendeten die localcolabfold-Implementierung30,31,32 von AlphaFold2 (AF2), um die Struktur von 2686 einzigartigen CsgA-Sequenzen vorherzusagen. Dies stellt eine repräsentative Teilmenge der gesamten CsgA-Datenbank dar und umfasst den gesamten Bereich der vorhergesagten Wiederholungen sowie die Vielfalt der Wiederholungsmotive. Wir erhalten einen durchschnittlichen pLDDT-Wert von 83 ± 9 für den gesamten Datensatz (siehe ergänzende Abbildung 1). Bei 741 Modellen (27 %) liegt der pLDDT-Wert über 90, während 237 Modelle (8 %) unter 70 liegen. DeepMind meldet pLDDT > 90 als hochgenaue Vorhersagen, zwischen 70 und 90 als gute Backbone-Vorhersagen und pLDDT <70 als geringes Vertrauen und mit Vorsicht zu behandeln31. Alle Modelle weisen eine ähnliche β-Solenoid-Architektur auf, wobei sich Curlin-Wiederholungen zu Strang-β-Bogen-Strang-Motiven falten, die sich vertikal stapeln, um eine doppelte, parallele β-Faltblattstruktur im Register mit einer einzelnen Strangversetzung (d. h. 2,4 Å) zu erzeugen. zwischen beiden Blättern (Abb. 2, ergänzende Abb. 2). Diese Topologie passt zu unseren KryoEM-Beobachtungen an reifen Curlin-Fibrillen, die wir weiter unten ausführlich diskutieren. Dies bedeutet auch, dass Variationen in der Anzahl der Wiederholungen linear mit der Längsachsendimension eines CsgA-Monomers korrelieren und dass das Curliom ein Kontinuum von Solenoidmonomeren überspannt.

Cartoon-Darstellung repräsentativer Beispiele (mit Uniprot-Zugangs-ID und AF2-pLDDT-Score) für jede Kategorie, mit einer Queransicht unten in Stabdarstellung, um die sterischen Reißverschlussreste und die Ausrichtung der Wiederholungen entlang der Längsachse hervorzuheben. Allen Modellen gemeinsam ist die gleiche Grundarchitektur, d. h. die helikale Anordnung sich wiederholender Strangwindungsmotive, was zu einem β-gefalteten Kern führt, der von zwei β-Arkaden flankiert wird. ein AF2-Modell von R15.5 aus Pontibacter korlensis, gekennzeichnet durch ein pseudozentrosymmetrisches Reißverschlussmotiv und sowohl N- als auch C-terminale Stränge auf derselben Schicht des β-Solenoids; b CsgA aus E. coli mit Endsträngen auf gegenüberliegenden Seiten des Solenoids und einem nicht zentrosymmetrischen Motiv sowie einem ungeordneten N-Terminus (1–22); c CsgA aus Sediminicola sp. YIK13 mit variablen sterischen Reißverschlussresten, die zu degenerierten Kernmotiven und arc2-Insertionen führen; d CsgA von Roseovarius indicus mit Schleifen- und Strangeinfügungen variabler Länge.

Als repräsentative Struktur von CsgA-Monomeren der CS-Klasse diskutieren wir das AF2-Modell von A0A0E3UX01 (pLDDT = 93,68; Abb. 2a), das 15 Curlin-Wiederholungen und eine zusätzliche halbe Wiederholung am C-Terminus aufweist (im Folgenden als R15.5 bezeichnet). ). AF2 sagt ein hochgradig regelmäßiges (der durchschnittliche Hauptketten-RMSD zwischen aufeinanderfolgenden Wiederholungen beträgt 0,18 ± 0,02 Å), linkshändiges β-Solenoid mit einer vernachlässigbaren Drehung voraus (durchschnittliches Hauptketten-RMSD der Top-5-AF2-Modelle: 0,48 ± 0,38 Å). Somit besteht das Monomer aus einer nahezu reinen translatorischen Stapelung der durch die Curlin-Wiederholungen gebildeten β-Bögen. Eine transversale Ansicht auf der Achse bietet weitere Einblicke in die strukturelle Natur des sterischen Reißverschlusses, der aus einem zentralen hydrophoben Kern besteht, der aus den Ψ1- und Ψ2-Resten in Motiv a und b besteht und auf beiden Seiten von einem Glutamin (Gln) flankiert wird durch ein Asparagin (Asn), das den pseudozentrosymmetrischen Kern bildet, der auf der Grundlage der Sequenzmerkmale von Motiv a und b vorhergesagt wird. Die Seitenketten-Amidgruppen von Gln 7 und 18 im Curlin-Kern (die Nummerierung wie im Konsensmotiv Abb. 1c) sind an einem ausgedehnten Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk beteiligt und bilden eine Leiter aus H-Bindungen mit dem äquivalenten Gln in den flankierenden Wiederholungen wobei die Hauptkettencarbonyle der gegenüberliegenden Stränge entweder zu ihrer übergeordneten oder benachbarten Wiederholung an den Positionen 13 bzw. 2 gehören (ergänzende Abbildung 3a). Diese Wechselwirkungen werden durch die Versetzung zwischen den beiden Blättern erleichtert und tragen wahrscheinlich wesentlich zur Stabilisierung der Blatt-auf-Blatt-Packung bei, was durchschnittlich 239 Å2 pro Wiederholung entspricht. Ψ1- und Ψ2-Reste in Motiv a und b verzahnen sich zu einem hydrophoben Kern, was wahrscheinlich für eine zusätzliche Stabilisierung der Blattpackung im β-Solenoid sorgt. Bemerkenswert ist, dass unsere HMM-Suche CsgA-ähnliche Sequenzen der CS-Klasse identifizierte, bei denen Ψ1 und Ψ2 einen rein hydrophilen Kern aus Ser/Thr bilden, wie z. B. A0A249PTX6 von Sinorhizobium fredii (ergänzende Abbildung 3b). Obwohl diese Sequenzen aus regelmäßigen Wiederholungen des kanonischen N-$-Ψ1-$-Ψ2-$-QXGXXN-$-Ψ1-$-Ψ2-$-QXGXX-Kernels bestehen und voraussichtlich das Curli-β-Solenoid annehmen, war dies nicht der Fall sind Teil eines Csg-Operons.

Während die Glns die Wechselwirkungen zwischen Wiederholungen sowie die Kreuzstrangpackung stabilisieren, bilden N1- und N12-Reste ein ausgedehntes H-Brückennetzwerk, das β-Bogen 2 bzw. β-Bogen 1 stabilisiert (ergänzende Abbildung 3a). Asn 1 befindet sich innerhalb der H-Brücken-Wechselwirkungsentfernung zum Carbonyl und Amid der Hauptkette der Reste G20, f in der +2-Curlin-Wiederholung und von N1 in der +1-Wiederholung, während N12 innerhalb der H-Brücken-Wechselwirkungsentfernung zur Hauptkette von X8 liegt. G9, X10 und N12 im +1-Rapport. Trotz geringer Sequenzkonservierung in den Positionen 10–11 über die 15 Wiederholungen hinweg sagt AF2 voraus, dass die Spur der Hauptkette durchgehend quasi isomorph ist (durchschnittlicher RMSD der Hauptkette von 0,04 ± 0,01 Å für äquivalente Positionen in den β-Bögen), was zu einem ununterbrochenen β führt -Arkade, die durch H-Bindungen der Hauptkette in aufeinanderfolgenden β-Bögen weiter stabilisiert wird. Wenn wir alle potenziellen polaren Kontakte im β-Solenoid-Kern (d. h. mit Ausnahme oberflächenlokalisierter Reste) auf die Anzahl der Wiederholungen normieren, dann enthält R15.5 29,6 H-Brücken-Kandidaten pro Wiederholung.

Als repräsentative Struktur von CsgA-Monomeren der NCS-Klasse ist die AF2-Vorhersage für CsgA aus E. coli (P28307; pLDDT23-131 = 88; Abb. 2b) ein linkshändiges β-Solenoid mit 5 Wiederholungen und 25,4 H-Bindungen Kandidaten pro Wiederholung (durchschnittlicher Hauptketten-RMSD der Top-5-AF2-Modelle: 0,20 ± 0,14 Å). Wie aus der Sequenzanalyse zu erwarten war, verliert die Packung der β-Faltblätter von Motiv a und Motiv b (Blatt 1 und 2) die Zentrosymmetrie, die in CsgA der CS-Klasse beobachtet wird. In EcCsgA wird die Asn-Säule in Position 1 durch eine Ser-Säule ersetzt, wodurch die zentrosymmetrische Natur des sterischen Reißverschlusses aufgehoben wird. Diese Reihe von Serinresten kann als funktioneller Ersatz von N1 angesehen werden, da sie auch den β-Bogen 2 stabilisieren, aber im Vergleich zu Asparagin ein geringeres H-Brückenpotential aufweisen. EcCsgA verliert auch die Zentrosymmetrie im hydrophoben Kern, der aus sperrigen hydrophoben Ψ1- und Ψ2-Resten in Motiv a (Position 3 und 5) im Vergleich zu kleinen hydrophoben Resten in Motiv b (14 und 16) besteht (Abb. 2b). Dies steht im Vergleich zu einer symmetrischen Packung der Ψ1- und Ψ2-Positionen von CS-Klasse-Sequenzen (Abb. 2a). Dennoch umfasst die Blatt-zu-Blatt-Packung in EcCsgA eine vergrabene Oberfläche von 231 Å2 pro Wiederholung, nur geringfügig weniger als in R15.5. Ein zusätzlicher Symmetrieverlust manifestiert sich auf der Ebene der β-Bögen: Bogen 1 besteht aus dem prototypischen XGXX-Motiv (in EcCsgA XGXG) und weist eine enge Krümmung auf, während Bogen 2 4–5aa breit ist und eine schlechte Sequenzkonservierung aufweist. Der durchschnittliche Hauptketten-RMSD zwischen aufeinanderfolgenden Wiederholungen beträgt 0,19 ± 0,01 Å, was dem für R15,5 erhaltenen Wert ähnelt. Der N-Terminus von EcCsgA enthält eine unvollständige Curlin-Wiederholung, die bekanntermaßen als Sekretionssignal dient und nachweislich in der reifen Faser für Proteasen zugänglich bleibt20,29. Der durchschnittliche pLDDT-Wert für diese ersten 22 Reste (N22) beträgt 47, und N22 wird zwischen verschiedenen AF2-Vorhersagen inkonsistent modelliert, entweder ungeordnet oder teilweise an das β-Solenoid-Gerüst angedockt. Schließlich endet das EcCsgA-Solenoid bei einer vollständigen Wiederholung, was bedeutet, dass die Untereinheit mit einem Überhang von Blatt 1 (Motiv a) und Blatt 2 (Motiv b) am N- bzw. C-Terminus endet. In R15.5, das in einer Halbwiederholung endet, befinden sich sowohl der N- als auch der C-terminale Überhang auf Blatt 1 (Abb. 2a).

Als Beispiel für ein Curlin-Monomer mit degenerierten Wiederholungen konzentrieren wir uns auf A0A0S1S4K2, für das AF2 ein linkshändiges, 10-strängiges β-Solenoid mit durchschnittlich 25,6 H-Brückenkandidaten pro Wiederholung vorhersagt (pLDDT = 77,3; Abb. 2c) (Durchschnitt). Hauptketten-RMSD der Top-5-AF2-Modelle: 0,62 ± 0,38 Å). Die A0A0S1S4K2-Sequenz zeigt Abweichungen in den N- und Q-Spalten von Motiv a und/oder b, einschließlich Substitutionen für hydrophobe Reste. Diese N/Q-Substitutionen unterbrechen den regulären, durch H-Brücken verstärkten sterischen Reißverschluss und werden häufig an den Positionen von Vorsprüngen im Bogen gefunden, der die jeweiligen Motive verbindet. Dies führt zu einem moderaten Anstieg des Hauptketten-RMSD über die benachbarten Wiederholungen (0,35 ± 0,07 Å). Auch hier haben diese Veränderungen in den Curlin-Kernresten keinen wesentlichen Einfluss auf die vergrabene Oberfläche für die Packung von Motiv a und b bei der Faltung des β-Solenoids, die durchschnittlich 230 Å2/Wiederholung umfasst. Eine weitere Abweichung von einer symmetrischen kanonischen Curlin-Falte setzt sich für unser viertes Beispiel fort. Das AF2-Modell für A0A0T5PAS6 besteht aus einem linkshändigen Solenoid mit 8 Wiederholungen, mit Einfügungen in den Strang 1 der Wiederholungen 1, 2, 3 und 4 (pLDDT = 75,9; Abb. 2d) (durchschnittlicher RMSD der Hauptkette der 5 besten AF2-Modelle). : 0,46 ± 0,26 Å). Der Netto-Wiederholungs-RMSD für äquivalente Cα-Positionen (d. h. ohne Berücksichtigung dieser Einfügungen) beträgt 0,45 ± 0,05 Å und spiegelt die lokalen Abweichungen von der idealen Solenoidgeometrie zur Aufnahme dieser Einfügungen wider. Dies führt jedoch weder zu einer Verringerung des gesamten H-Brückenpotentials, das 29,5 pro Wiederholung beträgt, noch zu einer deutlich veränderten Gratoberfläche/Wiederholung, die 220 Å2 umfasst.

Eine genaue Untersuchung der Bibliothek von CsgA-AF2-Modellen ergab eine Unklarheit in der Händigkeit der vorhergesagten β-Solenoide. Diese Mehrdeutigkeit korrelierte mit der Anzahl der Sequenzen in den Mehrfachsequenz-Alignments. Bei der Ausführung ohne MSA oder bei dünn besiedelten MSAs (d. h. bei Verwendung des Standard-mmseq2 in Colabfold) wurden CsgA-Sequenzen häufig als rechtshändige β-Solenoide vorhergesagt, wohingegen dieselben Sequenzen durch AF2 mit gut besiedelten MSAs laufen, die konsistent mit Jackhmmer erhalten wurden führen zu einem linksdrehenden β-Solenoid. Dies ist in der ergänzenden Abbildung 4 für R15.5 dargestellt. Interessanterweise weisen beide Vorhersagen ähnliche vorhergesagte Ausrichtungsfehler, Kontaktkarten und Gesamt-pLDDT- (rechts: 92,8; links: 93,7) und pTM-Werte (rechts: 0,91; links: 0,89) auf, was eine a-piori-Differenzierung zwischen beiden Möglichkeiten ausschließt. Die MolProbity-Analyse33 der am besten bewerteten AMBER-entspannten Modelle für die R- und L-Variante ergab insgesamt ähnliche Strukturstatistiken, wobei der MolProbity-Score im Wesentlichen nicht unterscheidbar war (rechts: 0,68; links: 0,65). Der bemerkenswerteste Unterschied zwischen beiden Modellen – abgesehen von der Händigkeit – war die Gesamtverdrehung der beiden Schichten im β-Solenoid. Rechtshändige Modelle (R) weisen durchgängig eine Drehung von ± 20° auf, während dies bei linkshändigen Modellen (L) nicht der Fall ist (ergänzende Abbildung 4).

Da kinetisch selektive Faktoren der jeweiligen Faltungswege fehlen, scheinen sowohl das L- als auch das R-Modell plausible theoretische Endzustände zu sein. Sind Curli-Fasern in der Praxis racemische Mischungen oder gibt es einen Unterscheidungsfaktor? Angesichts der Drehung ungleich Null für das R-Modell sagen wir voraus, dass eine R15,5-R-Protofibrille helikaler Natur wäre, mit einem Anstieg und einer Drehung von 7,2 nm und 20° (d. h. 4,8 Å und 1,3° pro Wiederholung). , während ein L-Protofibrille nur aus Translationssymmetrie konstruiert werden würde (weitere Informationen finden Sie im folgenden Abschnitt sowie in der ergänzenden Abbildung 4). Ersteres steht in direktem Widerspruch zu unseren KryoEM-Daten (siehe unten), da eine helikale R-Protofibrille 2D-Klassendurchschnitte erzeugen würde, die ein Kontinuum von Fibrillenorientierungen abdecken, was experimentell nicht beobachtet wird, was darauf hindeutet, dass R-Protofibrillen sehr selten sind oder fehlen Datensatz. Ähnlich wie R15.5 erzeugt AF2(mmseqs2) ein rechtshändiges Modell für EcCsgA mit einer Drehung um 11° (d. h. ~2,2° pro Wiederholung), während das linkshändige Modell AF2(jackhmmer) eine reine Translation des Curlin zeigt wiederholen. Auch hier wird nur Letzteres durch unsere KryoEM-Daten zu Curlin-Fasern gestützt, die aus einem bakteriellen Biofilm gereinigt wurden (siehe unten im Detail). Dies steht auch im Einklang mit der hochauflösenden AFM-Bildgebung, die keine helikale Verdrehung in einzelnen EcCsgA-Fasern erkennen ließ34. So wurde festgestellt, dass zumindest für P. korlensis und E. coli CsgA sowohl in vitro als auch ex vivo Curli-Fasern (überwiegend) aus Untereinheiten bestehen, die ein linksdrehendes β-Solenoid umfassen. Obwohl bisher unbeobachtet, kann nicht ausgeschlossen werden, dass unterschiedliche CsgA-Homologe oder unterschiedliche Umweltbedingungen eine Rechtshändigkeit begünstigen.

Nachdem wir die strukturellen Merkmale eines Curlin-Monomers ermittelt haben, wenden wir uns den Vorhersagen homo- und heteromerer Anordnungen zu. Curlin-Monomere enden in zwei offenkantigen β-Faltblättern mit einer Versetzung von 2,4 Å, was zu einem Einzelstrangüberhang an beiden Enden führt. Somit zeigen Untereinheiten einen Überhang von Motiv a (Blatt 1) ​​am N-Terminus und einen Überhang von Motiv b (Blatt 2) oder Motiv a (Blatt 1) ​​am C-Terminus für Sequenzen, die in einer vollständigen oder halben Curlin-Wiederholung enden. bzw. (Abb. 3a). Wenn die Packungsgrenzfläche zwischen zwei Monomeren mit hinreichender Sicherheit vorhergesagt werden kann, kann ein Modell für die Curli-Architektur abgeleitet werden. Dazu vergleichen wir zunächst die Fähigkeiten von AF2, spezifische Merkmale faseriger Proteinanordnungen genau vorherzusagen und zu reproduzieren, wie etwa das Vorhandensein einer Schraubenachse und die Faserpolarität. Zu diesem Zweck führten wir AF2-Vorhersagen der Bactofilinfilamente von Thermus thermophilus durch, die aus durchgehend verbundenen β-helikalen Domänen bestehen (hinterlegt am 23.04.2019, AF2-Trainingssatz 30.04.2018). Wir verwenden die Filament-KryoEM-Struktur 6RIB als Referenz und vergleichen sie mit einem Trimermodell (pLDDT = 86,2; pTMscore = 0,75), das unter Verwendung des AF2-Multimers vorhergesagt wurde (ergänzende Abbildung 5). Insgesamt besteht eine hervorragende Übereinstimmung zwischen der vorhergesagten und der experimentellen Struktur mit einem Gesamtatom-RMSD von 1,53 Å (2298 Atome). AF2 sagt genau die apolare Natur der Filamente (dh die Abfolge von Kopf-an-Kopf- und Schwanz-an-Schwanz-Grenzflächen), die Händigkeit des β-Solenoids, den ungeordneten N- und C-terminalen Schwanz sowie die Helix voraus Natur (d. h. Vorhandensein einer Schraubenachse). Dies stärkte unser Vertrauen in die vorgeschlagene AF2-Methodik für die Curlin-Modellierung und veranlasste uns, einen AF2-CsgA-Trimer genauer zu betrachten.

a Schematische Darstellung der Monomerbausteine ​​für CsgA-Sequenzen, die in einer vollständigen oder halben Wiederholung enden und einen C-terminalen Motiv-b- bzw. Motiv-a-Überhang erzeugen. Die Kopf-Schwanz- oder Schwanz-Schwanz/Kopf-Kopf-Stapelung von CsgA-Monomeren führt zu einer Faser mit einer kreuzmonomeren Stapelung der β-Arkaden. Das Stapeln von Kopf zu Schwanz führt zu einer parallelen β-Arkade in der gesamten Faser, Kopf-Kopf/Schwanz-Schwanz wechselt die Richtung der β-Stränge, wodurch eine antiparallele Schnittstelle entsteht. Eine Kopf-Schwanz-Stapelung von CsgA-Sequenzen mit halbem Wiederholungsschwanz impliziert eine 21-Schrauben-Achse für eine produktive H-Brücke der β-Arkade an den Schnittstellen der Untereinheiten. b, c Multimere CsgA-Anordnungen stellen minimalistische Protofibrillen dar: b EcCsgA-Trimer, wie von AF2 vorhergesagt, wobei Monomere „Kopf-an-Schwanz“ über eine einzigartige R5/R1-Schnittstelle stapeln, was zu einer polaren Protofibrille (nur translatorische Symmetrie) mit einem R1- und R5-Terminus führt . Stabdarstellung der R5/R1-Schnittstelle mit mutmaßlichen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Ketten, dargestellt in gestrichelten Linien; Für das zentrale CsgA-Protomer sind Motiv a und Motiv b rot bzw. blau gefärbt. c R15.5-Dimer, wie von AF2 vorhergesagt, wobei zwei Monomere „Kopf an Schwanz“ gestapelt sind und eine 180°-Rotation relativ zueinander ausführen. Die Protofibrille verfügt über eine einzigartige Art intermolekularer Grenzfläche (R15.5/R1) mit einer Translationssymmetrie von 21 und polaren Enden, die durch Wiederholungen von R1 bzw. R15.5 gebildet werden.

Das AF2-Modell eines EcCsgA-Trimers besteht aus drei Kopf-an-Schwanz-gestapelten Monomeren, die über ihre R5/R1-Wiederholungen mittels β-Faltblatt-Augmentation interagieren und eine kontinuierliche Solenoidfalte bilden (Abb. 3b, ergänzende Abb. 6). Diese Protofibrillenanordnung ist aus reiner Translationssymmetrie aufgebaut, ohne dass eine Schraubenachse vorhanden ist oder eine messbare Drehung vorliegt. Wenn wir die Grenzfläche zwischen zwei Monomeren betrachten, finden wir einen nahezu nahtlosen Übergang des β-Solenoid-Wasserstoffbindungsnetzwerks, d. h. die R5/R1-Grenzfläche enthält 23,3 mutmaßliche H-Brücken (gemittelt über das Trimer), was der Durchschnittszahl entspricht von H-Brücken-Kandidaten zwischen den Wiederholungen innerhalb eines einzelnen CsgA-Monomers. Diese Kontinuität wird durch die niedrigen RMSD-Werte zwischen R1 und R5 sowie die Erhaltung der sterischen Reißverschlussreste erleichtert, was zu einer intermolekularen Digitalisierung führt, die den intramolekularen Kontakten sehr ähnlich ist. Die MotivA-Arc1-MotifB-Arc2-β-Arkade wird ununterbrochen fortgesetzt. AF2 sagt voraus, dass N22 ungeordnet und von der Curli-β-Arkade ausgeschlossen ist und daher aus den Fasern herausragt, was mit seiner berichteten proteolytischen Anfälligkeit in reifen Curli-Fasern übereinstimmt20.

Es ist erwähnenswert, dass CsgA, obwohl dies von AF2 nicht vorhergesagt wird, möglicherweise auch durch aufeinanderfolgende Schwanz-an-Schwanz-/Kopf-an-Kopf-Wechselwirkungen oligomerisieren kann (Abb. 3a, ergänzende Abb. 6). Zu diesem Zweck brachten wir zwei CsgA-Moleküle manuell in R5/R5-Kontakt und führten ein lokales Andocken mit RosettaDock durch, um die lokale Geometrie zu optimieren (Schnittstellenwert: −9,5). Wir verweisen dieses Schwanz-zu-Schwanz-Dimer auf ein ähnlich optimiertes Kopf-zu-Schwanz-CsgA-Dimer, bei dem wir das AF2-Modell als Eingabe für RosettaDock verwendet haben (Schnittstellenwert: −15,5). Beide Modelle haben eine ähnliche Anzahl mutmaßlicher H-Brücken an der Dimer-Grenzfläche (23 gegenüber 21), aber das Schwanz-zu-Schwanz-Modell ist antiparallel gepackt, was einen lateralen Versatz von 1 Rest zwischen beiden Strängen an der Grenzfläche auslöst und schlecht ist Dadurch entstehen Kontakte in den sterischen N/Q-Reißverschlüssen an den Arkaden. Die Extrapolation eines solchen Dimers auf eine Protofibrille erzeugt ein gestaffeltes Muster mit einer Frequenz von 2 nm, das wir experimentell nicht beobachten (siehe Abb. 4c), was das von AF2 erzeugte Kopf-Schwanz-Modell bestätigt. Darüber hinaus haben wir zuvor festgestellt, dass EcCsgA-Fasern eine polare Ausdehnungskinetik aufweisen, eine Beobachtung, die nur mit einer Kopf-Schwanz-Wechselwirkung der Curli-Untereinheiten vereinbar ist.

ein KryoEM-Bild der extrazellulären Matrix von MC4100 mit geringer Vergrößerung (25k), das zwei Arten von Fasern auflöst: weißer Pfeil, Curli-Filamente; schwarzer Pfeil, nicht identifizierte Fasern, möglicherweise eDNA oder Polysaccharid; b KryoEM-Bild bei 60.000 isolierten Curli-Fasern; c Seitenansicht RELION 4.0 2D-Klassendurchschnitt der Curli-Protofibrillen; d KryoEM-Bild bei 60.000 rekombinanten R15.5-Fasern, die in vitro in 15 mM MES 6.0 gebildet wurden; e, f RELION 4.0 2D-Klassendurchschnitt in der Draufsicht und Seitenansicht von R15,5; g, h Oben, seitlich (g; dargestellt als Querschnitt), abgewinkelt und auf der Achse h-Ansicht eines RELION 4.0 Class3D-KryoEM-Volumens einer R15,5-Fibrille, dargestellt bei Level 0,0137; Andocken einer trimeren Einheit des R15.5 AF2-Modells im KryoEM-Volumen mit abwechselnd orange und cyanfarbenen Monomeren. Alle KryoEM-Bilder sind repräsentativ für Raster von mehr als 10 unabhängigen Probenvorbereitungen.

Für R15.5 scheint der Kopf-Schwanz-Mechanismus der Dimerisierung zunächst ähnlich zu sein, d. Allerdings hat R15.5 eine ungerade Anzahl an Strängen (d. h. 31), was dazu führt, dass das Motiv einen Überhang sowohl am N- als auch am C-Terminus aufweist. Diese Geometrie ermöglicht keine einfache translatorische Kopf-Schwanz-Wechselwirkung (Abb. 3a). Vielmehr würde eine ordnungsgemäße Übereinstimmung zweier Motive, die an einer Dimer-Grenzfläche überhängen, eine Faser erfordern, die aus aufeinanderfolgenden Kopf-Kopf-Schwanz-Schwanz-Wechselwirkungen (Abb. 3a) oder Kopf-Schwanz-Wechselwirkungen mit einer zweifachen Schraube, d. h. 180, besteht ° Drehung aufeinanderfolgender Untereinheiten entlang der Faserlängsachse (Abb. 3a). Bei der Beurteilung der Wachstumsdynamik einzelner Fasern für den In-vitro-Zusammenbau von R15.5 mittels AFM-Bildgebung stellten wir fest, dass Fasern einen langsamen (d. h. 0,8 ± 0,1 nm/s) und einen schnellen (4,5 ± 0,1 nm/s) ausfahrenden Pol aufwiesen (ergänzende Abbildung). 8), was darauf hindeutet, dass Fasern polar sind und daher wahrscheinlich eine Kopf-Schwanz-Wechselwirkung eingehen. Die Disulfidbildung von über die R15.5-Schnittstelle eingeführten Cys-Resten erfolgte gemäß einer 21-Schrauben-Achse (ergänzende Abbildung 8a, b), und auch die De-novo-Vorhersage durch AF2 zeigte eine Kopf-an-Schwanz-21-Schraube in der Untereinheit-Untereinheit Schnittstelle (Abb. 3c und ergänzende Abb. 7). Schließlich zeigte ein Vergleich von In-silico-Modellen von Kopf-Schwanz- und Schwanz-Schwanz-Dimeren, die mit RosettaDock35 erhalten wurden, dass ein nahtloser Übergang der β-Arkade zwischen zwei Molekülen nur im ersteren auftritt, was durch die zentrosymmetrische Natur der sterischen Struktur erleichtert wird Reißverschluss in diesem Monomer der CS-Klasse. Für diese Schraubenachsen-R15.5-Schnittstelle werden 32 mutmaßliche H-Brücken gefunden (anstelle von nur 12 für Schwanz-Schwanz-Wechselwirkungen, ergänzende Abbildung 7), was bemerkenswert gut mit dem Durchschnitt von 29,6 zwischen Wiederholungen innerhalb eines R15.5 übereinstimmt Monomer. Wir stellen außerdem fest, dass der zweite β-Bogen in den letzten beiden Wiederholungen von 4aa auf 3aa reduziert wird. Dies wiederum ermöglicht eine perfekte Fortsetzung der β-Arkade 2 des ersten Monomers in die β-Arkade 1 des zweiten Monomers über die Grenzfläche hinweg.

Angesichts der hohen Sequenz- und Strukturkonservierung im CsgA-Amyloidkern untersuchten wir schließlich heteromere Kontakte zwischen CsgA-Homologen verschiedener Spezies. Dies ist relevant, da gezeigt wurde, dass es zu einer promiskuitiven Kreuzaussaat zwischen Curli kommt, die in Biofilmen zwischen Arten produziert werden36. Dazu haben wir uns ein AF2-Modell eines CsgA-CsgA Citrobacter-Salmonella-Dimers angesehen (pLDDT: 79,8; pTMscore: 0,78; ergänzende Abbildung 9). Dieses Dimer ist konzeptionell identisch mit dem in Abb. 3a gezeigten Homotrimer, da die R5-Wiederholung von CsgA_Citrobacter an die R1-Wiederholung von CsgA_Salmonella andockt, ohne dass eine Schraubenachse vorhanden ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die konservierte Wiederholungsarchitektur das Andocken unterschiedlicher Monomere an Fibrillen erleichtert und dadurch die Kreuzreaktivität von Curlinen zwischen den Spezies erleichtert.

In ihrem natürlichen Kontext werden Curli-Fasern als unregelmäßige, verwickelte Masse produziert, die unter Bedingungen der Biofilmbildung den Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix (ECM) darstellt18. Dies wird durch das KryoEM-Bild mit geringer Vergrößerung (1,88 Å/Pix; 20k; Abb. 4a) veranschaulicht, das wir von der ECM aufgenommen haben, die von E. coli MC4100 nach 72-stündigem Wachstum auf YESCA-Agar bei RT erzeugt wurde. In Abb. 4a sind mehrere filamentöse Strukturen zu erkennen, die von einer Bakterienzelle ausgehen und diese umhüllen. Versuche, aus digital extrahierten Filamentsegmenten stabile KryoEM-Klassendurchschnitte zu generieren, waren erfolglos. Daher isolierten wir Ex-vivo-Curli-Fasern nach dem von Chapman et al.37 optimierten Extraktionsprotokoll. Extrahierte Curli-Fraktionen wurden einer milden Ultraschallbehandlung (30 s; 10/10 s Ein-/Aus-Impulse) unterzogen, um sie in Mikrometergröße zu brechen und zu entwirren Curli-Konglomerate, die zu einer verteilten Curli-Probe führten, aus der ein KryoEM-Datensatz bei 60.000-Vergrößerung (0,784 Å/Pixel; Abb. 4b) gesammelt wurde. Obwohl die meisten Curli immer noch als große Multifilamentbündel existierten, ermöglichten einzelne Faserfragmente eine 2D-Mittelung mit RELION 4.038, was einen einzigartigen Klassendurchschnitt in der Seitenansicht mit vorhandenen Sekundärstrukturmerkmalen ergab (Abb. 4c). Dies ergab eine Cross-Beta-Architektur, die durch eine Wiederholung von 4,8 Å, eine Fibrillenbreite von 20 Å und einen Abstand von einer halben Einheit zwischen gegenüberliegenden β-Strängen in den beiden Schichten des β-Solenoids gekennzeichnet ist. Das entsprechende Leistungsspektrum zeigt zwei breite Maxima bei 1/4,8 Å−1 und 1/10 Å−1 in einem Winkel von ~ 13° und 90° zum Meridian, was den versetzten Abstand der β-Stränge um 4,8 Å widerspiegelt ~10 Å Abstand der beiden β-Faltblätter (Ergänzende Abbildung 10). Diese Zahlen stimmen weitgehend mit den von AF2 vorhergesagten Monomer- und Faserarchitekturen von EcCsgA überein. Das Fehlen anderer Maxima im Leistungsspektrum deutet auf das Fehlen einer Helixsymmetrie hin, obwohl eine niedrige Helixsymmetrie in Form einer zweizähligen Schraubenachse allein aufgrund dieser Daten nicht ausgeschlossen werden kann. Unsere Analyse der AF2-Trimerstruktur legt jedoch nahe, dass das Vorhandensein einer Schraubenachse unwahrscheinlich ist, und auch die von Chen et al. stimmen mit einer rein translatorischen Kopf-Schwanz-Vermehrung von CsgA-Untereinheiten in Curli-Fasern überein .

Wir stellen außerdem fest, dass es keine klaren Merkmale gibt, die die Grenzfläche zwischen zwei aufeinanderfolgenden CsgA-Monomeren abgrenzen (vgl. ein einzelnes Monomer besteht aus 5 Beta-Arc-Beta-Motiven), und dass es auch keine niedrig aufgelösten Maxima im Leistungsspektrum gibt, aus denen a Die Faserperiode konnte abgeschätzt werden (ergänzende Abbildung 10a). Dies bedeutet, dass bei der lateralen Ausrichtung der Curli-Segmente im Klassifizierungsprotokoll kein Fibrillenregister gefunden wurde – eine wahrscheinliche Folge des quasi-nahtlosen Übergangs zwischen aufeinanderfolgenden Monomeren und der nahezu isomorphen Natur der Wiederholungen. Aufgrund des Mangels an zusätzlichen hochauflösenden Klassendurchschnitten, die unterschiedlichen Fibrillenorientierungen entsprechen, war eine 3D-Rekonstruktion zu diesem Zeitpunkt nicht möglich. Versuche, mit in vitro gezüchteten EcCsgA-Fasern34 weitere 2D-Klassen zu erhalten, waren aufgrund der hohen Bündelungsneigung der Fasern erfolglos.

Angesichts der kolloidalen Instabilitätsprobleme von EcCsgA haben wir beschlossen, die Struktur eines CsgA-Homologs zu untersuchen. Hierfür haben wir R15.5 aufgrund seines hohen Asp- und Glu-Gehalts (20 %; pI = 2,98) ausgewählt, was uns zu der Hypothese führt, dass R15.5-Protofibrillen aufgrund abstoßender Elektrostatik weniger dazu neigen, sich zu verheddern. R15.5 wurde rekombinant exprimiert und aus Einschlusskörpern gereinigt und nach dem Pufferaustausch polymerisieren gelassen. Die TEM-Analyse ergab kräuselartige Fasern, die nur eine minimale Aggregation zwischen den Fibrillen aufwiesen (Abb. 4d). Angesichts seines hohen Asp- und Glu-Gehalts, der in sterischen Leitern auf der Oberfläche des R15.5-Motivs a (Blatt 1) ​​vorhanden ist, haben wir getestet, ob die R15.5-Fibrillenbildung durch Änderung des pH-Werts oder Verwendung von Ca2+ als Gegenion zur Vermeidung von Ladungsabstoßung eingestellt werden kann . Etwas unerwartet bildete R15.5 in Gegenwart von 10 mM EDTA, 15 mM MES 6,0 (ergänzende Abbildung 11) oder in 50 mM Bicin pH 9,0 (ergänzende Abbildung 11) immer noch Fibrillen, Bedingungen, unter denen sich die Asp- oder Glu-Leitern bildeten Es wurde erwartet, dass die Faltung und Polymerisation von R15.5 zu einer Ladungsabstoßung führt. Wenn wir jedoch 15 mM MES 6,0 mit 10 mM CaCl2 ergänzen (ergänzende Abbildung 11) oder den Puffer auf 50 mM Na-Acetat 4,0 ändern (ergänzende Abbildung 11), beobachteten wir einen deutlichen Anstieg der fibrillären Aggregate. Bemerkenswerterweise wurde festgestellt, dass der pH-Wert keinen signifikanten Einfluss auf die Polymerisationskinetik von R15.5 hatte (ergänzende Abbildung 12), wie anhand des zeitlichen Abfalls der 1D-H-NMR-Spektren (R15.5 zeigt eine schlechte Bindung an ThT) beurteilt wurde, die im Verlauf gesammelt wurden des Fibrillierungsprozesses. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Amyloidogenität von R15.5 robust ist, die Elektrostatik des Lösungsmittels jedoch bis zu einem gewissen Grad die Neigung zur Faseraggregation beeinflussen kann.

In Abb. 4d zeigen wir ein repräsentatives KryoEM-Bild von in vitro gezüchteten R15.5-Fibrillen und die entsprechenden RELION 4.0 2D-Klassendurchschnitte, die wir als Vorder- und Seitenansicht zuordnen. Die R15.5-Seitenansicht ist nahezu identisch mit der Seitenansicht von E. coli-Curli, was darauf hindeutet, dass Ex-vivo-Curli und In-vitro-R15.5-Fibrillen auf Faltungsebene strukturell äquivalent sind und im Wesentlichen mit den AF2-Vorhersagen übereinstimmen. Zusätzliche 2D-Klassenmittelwerte, die verschiedenen gedrehten Ansichten entlang der Fibrillenachse entsprechen, sind in der ergänzenden Abbildung 13a dargestellt. Sie entsprechen gut den simulierten 2D-Klassenmittelwerten, die in Cryosparc v3.3.2 unter Verwendung eines R15.5 AF2-Trimers als Eingabemodell generiert wurden (ergänzende Abbildung). . 13b). Refine3D in RELION 4.0 unter Verwendung einer helikalen Rekonstruktion mit festen Verdrehungs- und Anstiegswerten, die 180° und 72 Å entsprechen (Symmetrie: C1; T-Wert: 25), unter Verwendung eines erstklassigen Class3D-Volumens aus einem früheren Job und der entsprechenden Partikel als Eingabe, ergab ein Volumen mit einer Auflösung von 7,6 Å (FSC 0,143; Tabelle S1), das mit den Strukturmerkmalen der vorhergesagten Modelle für CsgA übereinstimmt, nämlich den Gesamtabmessungen der Fibrillen, der Kreuz-β-Architektur, der Staffelung zwischen gegenüberliegenden Strängen in den Curli-Wiederholungen usw Die charakteristischen Abstände zwischen den Wiederholungen betragen 4,8 Å. Das Andocken eines R15.5 AF2-Modells (Abb. 4h) zeigt eine gute Übereinstimmung zwischen dem experimentellen KryoEM-Volumen und der vorhergesagten β-Solenoid-Architektur. Der nahezu isomorphe und zentrosymmetrische Charakter der Curlin-Wiederholungen führt dazu, dass es an niedrig aufgelösten Merkmalen mangelt, um die frühen Phasen der 3D-Partikelausrichtung zu steuern. Strategien zur Einführung oberflächenexponierter Referenzmarken (z. B. His-Tag-Markierung mit Ni-NTA-Nanogoldpartikeln mit 5 nm Durchmesser; Einfügung gefalteter Domänen in Arc-1 oder Arc-2 von Wiederholung 8; Immunfärbung mit monoklonalen Maus-Anti-His-Antikörpern). ) führte nicht zu einer verbesserten 2D- und/oder 3D-Partikelausrichtung. Das gemeldete Refine3D-Volumen stellt daher eine Karte dar, die in Längsrichtung über die Curlin-Wiederholungen gemittelt wird (Abb. 4g).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Curli-Protofibrille aus einem hochgradig regelmäßigen supermolekularen β-Solenoid mit einer fehlenden oder vernachlässigbaren helikalen Drehung besteht. Interessanterweise neigen Curli-Fibrillen neben der Bildung einzelner Protofilamente auch dazu, unregelmäßige oder sogar systematische Strukturen höherer Ordnung zu bilden (Abb. 5). Beispielsweise zeigen EcCsgA-Curli häufig eine laterale Assoziation zu dickeren Bündeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 17 ± 9 nm (Mittelwert, Standardabweichung, n = 108) und Ausreißern bis zu 48 nm (Abb. 5g). R15.5 zeigte eine Reihe lateraler Assoziationen, die von einzelnen Fibrillen (siehe oben) über reguläre Fibrillendimere bis hin zu planaren Anordnungen reichten, in denen mehrere Fibrillen organisiert nebeneinander gestapelt sind (Abb. 5a). Die 2D-Klassenmittelung von kastenförmigen Segmenten aus solchen Faserschichten löst mehrere parallel verlaufende R15.5-Fibrillen auf (Abb. 5b). Für die 3 Fibrillen im mittleren Bereich der Faserschicht lösen wir eindeutig β-Solenoid-Merkmale auf. Die Stränge jeder Fibrille sind an den Strängen der benachbarten Fibrille ausgerichtet, was stark darauf hindeutet, dass sie spezifische Kontakte zwischen den Fibrillen herstellen. Wenn die Packung zwischen den Fibrillen unspezifisch wäre, könnte man davon ausgehen, dass die Fibrillen übereinander gleiten, was einen 2D-Klassendurchschnitt ergeben würde, bei dem nur bei einer einzelnen Fibrille die Sekundärstrukturmerkmale aufgelöst wären. Eine solche Situation wird bei EcCsgA-Faserdimeren beobachtet, bei denen eine Fibrille auf der Ebene der Sekundärstruktur aufgelöst ist, während die Partnerfibrillen im 2D-Klassenmittel eine verschmierte Projektion zeigen (Abb. 5h). Für R15.5 nehmen wir an, dass die Packungskontakte zwischen R15.5-Fibrillen über Elektrostatik vermittelt werden. Insbesondere sagt das AF2-Modell von R15.5 ein quadratisches Gitter aus Glutamat- und Aspartatresten auf der dem Lösungsmittel ausgesetzten Motivflanke voraus, wodurch ein großer negativ geladener Fleck entsteht (Abb. 5c). Aufgrund der Schraubenachse einer R15,5-Fibrille wechselt dieser negative Patch die Seiten entlang der Fibrillenachse, wodurch die Bildung von Salzbrücken zwischen benachbarten Fibrillen erleichtert wird, die durch zweiwertige Kationen auf beiden Seiten der Fibrille vermittelt werden (Abb. 5d). ). Wenn wir die Pufferlösung mit einem stöchiometrischen Überschuss an Ca2+-Ionen ergänzen – 30 mM End-CaCl2 zu 3 µM R15,5- in Gegenwart von 15 mM MES pH 6,0 und 250 µM Kaliumphosphat hinzugefügt, dann beobachten wir keine Blattbildung mehr, sondern eher eine Blattbildung Verkrustung einzelner R15.5-Fibrillen (Abb. 5e). TEM löst eine R15,5-Fibrille mit einem Durchmesser von 2,5 nm im Kern auf, die von einer dicken Kruste mit einer Größe von 10–30 nm umgeben ist (Abb. 5f). Wir gehen davon aus, dass es sich bei dieser Kruste um eine anorganische Ablagerung handelt, die aus einer kristallinen Phase aus Calciumphosphat besteht, die auf dem D/E-Gitter Keime bildet (Abb. 5c).

ein CryoEM-Bild von seitlich gestapelten, parallelen R15.5-Fasern, die in einer planaren Anordnung organisiert sind; b 2D-Klassendurchschnitt der eingerahmten Segmente der Kernregion von R15.5-Arrays, wobei die Sekundärstruktur der drei zentralen Fibrillen aufgelöst ist; c Regelmäßige Anordnung von oberflächenexponierten Asp- und Glu-Resten auf der Blatt-1-Flanke des R15.5-Monomers; d Idealisiertes Modell für die supramolekulare Organisation von R15.5-Fibrillen, vermittelt durch Salzbrücken zwischen den Fibrillen. Die Schraubenachse erleichtert abwechselnde Bindungsschnittstellen zwischen aufeinanderfolgenden Fibrillen; e Verkrustung von R15.5-Fibrillen in Gegenwart von 30 mM CaCl2 und Spurenmengen (±250 µM) von KH2PO4/K2HPO4; f Vergrößerung des umrahmten Bereichs in e, Auflösung des Fibrillenkerns (gelbe Pfeile), umgeben von einer dicken Ablagerung; g Violindiagramm des Durchmessers von Ex-vivo-Curli-Fasern, gereinigt aus der ECM von MC4100: durchgezogene Linie = Median, gestrichelte Linien = Quartile (n = 108 Fasern); h 2D-Klassendurchschnitt von Curli-Fasern, wobei nur eine einzelne Fibrille mit aufgelösten Sekundärelementen vorhanden ist. Die KryoEM-Bildgebung der Curli-Organisation und -Verkrustung ist repräsentativ für Raster von >5 unabhängigen Probenvorbereitungen.

Die meisten Curli-Gencluster kodieren zwei CsgA-ähnliche Proteine19. In Enterobacteriacea wie Escherichia und Salmonella, wo das Curli-Operon am besten untersucht ist, differenzieren sich diese CsgA-ähnlichen Sequenzen in eine Haupt-Curli-Untereinheit CsgA, die die selbstorganisierende Hauptkomponente der Curli-Fasern bildet, und eine Nebenuntereinheit CsgB, die fungiert als Keimbildner der CsgA-Amyloidogenese sowohl in vitro als auch in vivo21,22,39. An der Zelloberfläche interagiert CsgB mit dem extrazellulären akzessorischen Faktor CsgF, eine Interaktion, die für die Keimbildung zellassoziierter Curli-Fasern wesentlich ist. In Abwesenheit von CsgB oder CsgF werden sekretierte CsgA-Untereinheiten als ungefaltete Monomere in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt20. Um einen Überblick über die Sequenz- und Struktureigenschaften von CsgB zu erhalten, haben wir alle eindeutigen Sequenzen aus der RefSeq-Datenbank abgerufen, die als CsgB oder Minor Curlin (n = 2296) annotiert waren, ihre Signalsequenz über Signalp640 entfernt und die Datensatzredundanz auf < gefiltert 90 % paarweise Sequenzähnlichkeit und alle Teileinträge entfernt. Die resultierenden reifen Domänensequenzen variierten in der Länge von 50 bis 561 Resten (ergänzende Abbildung 14a). Um das globale Alignment und die MSA-Erzeugung zu erleichtern, haben wir unsere Analyse auf CsgB-Varianten beschränkt, die eine ähnliche Anzahl von Curlin-Wiederholungen aufweisen (d. h. 5 Wiederholungen, was Sequenzlängen zwischen 100 und 160 Aminosäuren übersetzt, um variable Längen der N22-Region zu ermöglichen N-Terminus). Die resultierende kuratierte MSA von n = 166 CsgB-Sequenzen ergab das folgende Konsenslogo (siehe ergänzende Abbildung 14c). Daraus wird deutlich, dass die zentrale Region des Konsenslogos konservierte Sequenzmotive aufweist, die dem für CsgA definierten Curlin-Amyloid-Kernel ähneln, d. h. N-$-Y1-$-Y2-$-Q. Es wurde vorgeschlagen, dass CsgB eine β-solenoidale Faltung annimmt, die strukturell der Architektur einer CsgA-Curli-Fibrille entspricht und daher mit dieser kompatibel ist. Die AlphaFold2-Vorhersage von E. coli CsgB zeigt ein linkshändiges β-Solenoid, das EcCsgA sehr ähnlich ist (Cα RMSD 0,88 Å, siehe ergänzende Abbildung 14b). Das Motiv a in R1 und beide Motive a und b der C-terminalen Wiederholung (R5) sind weniger konserviert und degenerieren von den kanonischen Motiven an der Position ihres ersten Asn. Häufig enthalten diese Positionen sperrigere Reste, wie Q, K und M in E. coli CsgB (EcCsgB), die seitlich aus der ansonsten quasi homotypischen Stapelung der Curlin-Wiederholungen herausragen, insbesondere an R5. Diese unvollständige Curlin-Wiederholung am C-terminalen Rand des CsgB-Monomers könnte der verringerten Neigung zur Faserassemblierung dieser kleinen Pilus-Untereinheit zugrunde liegen. Frühere Studien haben auch auf die Rolle von R5 bei der CsgF-CsgB-Wechselwirkung hingewiesen.

Unser strukturelles Verständnis von Amyloidfasern hat im letzten Jahrzehnt große Fortschritte gemacht. Ein gemeinsamer Nenner, der aus dem umfangreichen Pool experimenteller Amyloidstrukturen hervorgegangen ist, ist die Serpentinenfalte, dh eine planare Anordnung von Betasträngen und Windungen, die supergefaltete Ultrastrukturen bilden, die durch sterische Reißverschlusswechselwirkungen und homotypische Strang-Strang-Stapelung stabilisiert werden . Bemerkenswerterweise können Amyloidfasern einen hohen Grad an Polymorphismus auf der Ebene der Serpentinenfalte und/oder auf der Ebene der Protofibrillenkontakte aufweisen2,3,4. Kleine Änderungen in der Primärsequenz oder in den Polymerisationsbedingungen können zu drastischen Veränderungen in der endgültigen Ultrastruktur der Amyloidfaser führen. Diese Empfindlichkeit der Quartärstruktur gegenüber den Anfangsbedingungen lässt sich wahrscheinlich auf die Tatsache zurückführen, dass für die meisten der beschriebenen Peptide/Proteine ​​kein (oder vielleicht sogar ein negativer) evolutionärer Druck bestand, sich in eine bestimmte Amyloidstruktur zu falten. Vielmehr werden die meisten charakterisierten Amyloide als unbeabsichtigte Folge eines Umweltauslösers gebildet, der zu einem Amyloidogeneseprozess führt, der stochastisch und anfällig für äußere Störungen ist.

Dies steht in scharfem Gegensatz zu funktionellen Amyloiden, die durch evolutionäre Prozesse gebildet wurden, bei denen Arten außerhalb des Signalwegs und unkontrollierbarer Polymorphismus durchaus biologisch unverträglich sein können und daher einer negativen Selektion unterliegen. Dies scheint tatsächlich bei Curli der Fall zu sein. Nach mehr als zwei Jahrzehnten Forschung an Curli gibt es keine experimentellen Beobachtungen von Faserpolymorphismus, das heißt, es liegen konsistente Berichte über Protofibrillendurchmesser und keine messbare helikale Symmetrie oder Änderungen davon vor. Ebenso finden wir keine Hinweise darauf, dass auch nur dünn besiedelte Faserklassendurchschnitte helikalen Curli-Protofibrillen entsprechen. Für Curli ist die strukturelle Konsistenz wahrscheinlich eine Notwendigkeit, die durch den Bindungsmechanismus an den extrazellulären CsgG-CsgF-CsgB-Komplex erforderlich ist. In einem keimbildungsabhängigen Fibrillierungsprozess könnten strukturelle Konformere durch den CsgG-CsgF-CsgB-Komplex auferlegt werden. Wir stellen fest, dass die Protofibrillen ex vivo isolierter und in vitro gebildeter Curli eine identische β-Solenoid-Struktur umfassen, was stark darauf hindeutet, dass diese Struktur eine intrinsische Eigenschaft der CsgA-Sequenz ist. Darüber hinaus ist die vorhergesagte Struktur der CsgB-Untereinheit der von CsgA sehr ähnlich, was eine strukturell passende Vorlage für die Faltung und den Zusammenbau von CsgA gewährleistet. Bei Curli liegt die strukturelle Konsistenz in Form einer konservierten β-Solenoidfaltung der Monomerbausteine ​​vor. Ungeachtet subtiler Variationen im β-Solenoid-Gerüst und seiner lokalen Dekorationen in Form von Insertionen sind AF2-Vorhersagen trotz großer Variationen in der Primärsequenz bemerkenswert konservativ. Wir finden einen durchschnittlichen AF2-pLDDT-Wert von 83, wobei etwa 8 % der Sequenzen einen niedrigeren pLDDT-Score von <70 aufweisen. Niedrige lokale pLDDT-Werte können ein Hinweis auf eine lokale Störung sein41. In Curli ermöglicht die dichte Packung der Curlin-Wiederholungen in der β-Solenoid-Struktur wenig bis gar keine lokale Unordnung, aber Curlin-Untereinheiten befinden sich vor dem Einbau in die Curlin-Faser in einem intrinsisch ungeordneten Zustand und müssen entfaltet bleiben, um den Transport durch sie zu ermöglichen der CsgG-Kanal20,42. Es ist interessant zu spekulieren, dass der niedrigere pLDDT-Wert für Curli-Untereinheiten den intrinsisch ungeordneten Charakter des Prä-Amyloid-Zustands widerspiegeln könnte.

β-Solenoide mit offenen Enden, denen Capping-Domänen fehlen43,44, führen zu einem Polymerisationsmechanismus, der hauptsächlich auf der Kompatibilität von Sekundärstrukturmotiven, d. h. β-Faltblattvergrößerung und β-Arkadenverlängerung, die überwiegend durch Hauptkettenkontakte vermittelt wird, beruht nur in geringerem Maße auf lokale Seitenkettenkontakte zwischen Ketten. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass die β-Solenoid-Faltung nicht nur bei Curli vorkommt, sondern auch häufig in nicht faserbildenden Proteinen vorkommt. Strukturelle Ähnlichkeitssuchen in der Proteindatenbank (http://www.wwpdb.org/) und der Alphafold-Proteinstrukturdatenbank (https://alphafold.ebi.ac.uk/) zeigen Hunderte nichthomologe (paarweise Sequenzidentität < 10%) Strukturen, die β-Solenoiddomänen mit hohen Z-Werten für die Curlin-Falte enthalten (>6 und höher; Tabelle S2, ergänzende Abbildung 15)45. Zu den bekannten Strukturen einschließlich β-Solenoiddomänen gehören unter anderem Frostschutz- und Eisbindungsproteine, Phagenschwanzspitzen, Adhäsine, Leu-reiche Wiederholungsproteine, Glykosidasen und S-Schicht-Proteine ​​(Tabelle S2; ergänzende Abbildung 15,a). Bei unserer Suche konnten keine polymerisierenden oder amyloidähnlichen Proteine ​​identifiziert werden. Stattdessen bilden die β-Solenoid-Domänen ein Strukturgerüst für die Proteinmonomere und keine Polymerisationseinheit. In diesen β-Solenoidproteinen verhindern strukturelle Mängel in den terminalen Solenoidmotiven oder Hinzufügungen sterisch blockierender Domänen die Polymerisation durch Kopf-Schwanz- oder Schwanz-Schwanz/Kopf-Kopf-Wechselwirkungen der Monomere. Bemerkenswerterweise identifiziert eine strukturelle Ähnlichkeit mit der menschlichen Alphafold-Proteinstrukturdatenbank mehrere Proteine, die offenkantige β-Solenoid-Domänen aufweisen (Ergänzungstabelle 2; ergänzende Abb. 15b), einschließlich extrazellulärer Matrixproteine ​​wie Mucine und Keratin-assoziierte Proteine ​​oder Suprabasin und uncharakterisiert Protein FLJ40521. Es ist jedoch unklar, ob diese β-Solenoiddomänen die Polymerisation in diesen Proteinen unterstützen. In Curli wird die strukturelle Erhaltung und Komplementarität im gesamten β-Solenoid durch einen hohen Grad an Konservierung einer begrenzten Anzahl von Schlüsselresten gewährleistet, die an sterischen Reißverschlusskontakten und der Stabilisierung von β-Arkadenstrukturen beteiligt sind. In diesem Zusammenhang stellen wir fest, dass Zhou und Mitarbeiter gezeigt haben, dass es zu einer promiskuitiven Kreuzaussaat zwischen Curli kommen kann, die in Biofilmen zwischen Arten entstehen – ein Prozess, der wahrscheinlich von einer konservierten Curli-Architektur abhängt36. Auch extrazelluläre Matrixkomponenten wie Curli wurden als abgesondertes öffentliches Gut vorgeschlagen, zumindest in Biofilmen einzelner Arten 46 . Die strukturelle Erhaltung in Curli-Untereinheiten kann die Bildung gemischter Fasern ermöglichen und somit den Beitrag von Curli-Monomeren mehrerer Arten zur Biofilmmatrix ermöglichen. Es ist interessant zu spekulieren, dass die Solenoid-Polymorphismen, die in den in dieser Arbeit definierten Konformations-Curlin-Familien, dh CS, NCS und D, gefunden werden, zu einer gewissen Spezifität der Curlin-Kreuzsaat und möglicherweise zu Multispezies-Biofilm-Assoziationen führen könnten. In den letzten Jahren wurde auch zunehmend auf die potenzielle Kreuzaussaataktivität von Curli, die von kommensalen und pathogenen Proteobakterien freigesetzt werden, auf humane pathologische Amyloide geachtet, wobei mehrere Berichte auf eine In-vitro- und In-vivo-Aussaat oder stimulierende Aktivität in Bezug auf die Amyloidogenität von α-Synuclein hindeuten12,47 ,48. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass unsere strukturelle Ähnlichkeit der menschlichen Alphafold-Proteinstrukturdatenbank mehrere Proteine ​​mit offenkantigen β-Solenoiddomänen mit hoher struktureller Ähnlichkeit zur Curlin-Falte identifiziert (Ergänzungstabelle 2; ergänzende Abbildung 15b). einschließlich extrazellulärer und mukosaler Proteine ​​wie Keratin-assoziierter Proteine ​​und Mucine. Dies könnte eine erhöhte Aufmerksamkeit für eine mögliche Wechselwirkung zwischen Schleimhautmatrixproteinen und Curli-produzierenden Kommensalen und Krankheitserregern im Darm- und Harntrakt erfordern.

Curli-Fasern besetzen eine einzigartige Nische in der Superfamilie der Amyloidproteine. Curli-Fasern zeigen nicht die Serpentinenfalte, die typischerweise bei pathologischen Amyloiden beobachtet wird oder kürzlich bei peptidbasierten funktionellen Amyloiden wie LARK-ähnlichen antimikrobiellen Amphibienmitteln beobachtet wurde14. Pathologische Amyloide entstehen durch homotypische Stapelung von Peptidfragmenten oder -regionen nach proteolytischer Freisetzung oder Entfaltung eines Polypeptids, das normalerweise einen globulären nativen Zustand annimmt. Curli-Untereinheiten nehmen einen globulären β-Solenoid-nativen Zustand ein, wobei die hohe Konservierung der Kernreste im Curlin-Wiederholungsmotiv zu einer quasi-homotypischen Stapelung der β-Stränge führt. CsgA vereint somit Eigenschaften globulärer Proteine ​​mit Merkmalen, die häufig mit Amyloiden in Verbindung gebracht werden, wie etwa einer gestapelten Cross-Beta-Struktur und einer keimbildungsabhängigen Polymerisation. Einerseits ist der Prä-Amyloid-Zustand der Curli-Untereinheiten nicht mit der Bildung amorpher Aggregate oder oligomerer Spezies verbunden, die häufig bei pathologischen Amyloiden vorkommen. Stattdessen bilden sich Curli-Samen während einer anfänglichen stochastischen Phase der Keimbildung, an die sich unmittelbar eine Phase der schrittweisen und selbstkatalysierten Ausbreitung von Cross-β-Fasern anschließt, die äußerst robust sind34. Andererseits deckt die MSA-Analyse jedoch starke koevolutionäre Kopplungen auf, die Abstandsbeschränkungen liefern, die nahezu deterministisch einen einzigartigen, gefalteten Monomerzustand vorhersagen. In dieser Hinsicht kann die Curli-Bildung auch als klassischer Polymerisationsprozess betrachtet werden, mit der zusätzlichen Komplexität, dass die Faltungsgeschwindigkeit wahrscheinlich mit der Aggregationsgeschwindigkeit vergleichbar ist und dass die Faltung nach erfolgter primärer Keimbildung als Vorlage dient. In diesem Modell würde der Einzelstrangüberhang an den Faserenden eine Templatoberfläche bereitstellen, die ankommende CsgA-Protomere rekrutiert und bei der Faltung hilft. Zumindest in vitro erstrecken sich EcCsgA-Curli-Fasern von beiden Faserenden, wenn auch mit deutlich unterschiedlicher Kinetik34. Zukünftige Studien werden erforderlich sein, um die strukturellen Grundlagen dieser polaren Wachstumskinetik zu bestimmen und um die Ausrichtung der Curli-Fasern auf der Zelloberfläche und biologisch aktiven Wachstumspole(n) zu bestimmen.

Schließlich verwenden wir großzügig die Terminologie des sterischen Reißverschlusses, um auf das Verflechtungsmuster nach innen gerichteter, konservierter Reste zu verweisen, aber für CsgA erfolgt diese Verzahnung nicht in derselben Ebene – wie es klassischerweise für PAs der Fall ist – aufgrund der zwischen den gegenüberliegenden Strängen schwanken. Es ist daher klar, dass Curli die Grenzen zwischen klassischen Proteinpolymeren und Amyloidfasern verwischt, was zu einer Neubewertung der Definition eines funktionellen Amyloids führt.

Um nach CsgA/B-Homologen zu suchen, haben wir eine lokale Refseq-Genomdatenbank eingerichtet (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/bacteria/). Die Genomsuche erfolgte mit HMMER v3.3.2 mit einem Schwellenwert von 1e−5 unter Verwendung der kuratierten Profil-Hidden-Markov-Modelle von Dueholm et al.19. N-terminale Leadersequenzen wurden mit SignalP_6.0 und aus diesem Satz reifer Sequenzen entfernt Doppelte Einträge wurden gelöscht. Curlin-Wiederholungssequenzen wurden mithilfe einer Reihe aufeinanderfolgender Suchvorgänge nach regulären Ausdrücken extrahiert. Zuerst haben wir nach X6QX10Q-Motiven gesucht (Regex:.{6}Q.{10}Q), dann haben wir iterativ nach NX5QX9-Motiven (mindestens 22 Reste) gesucht, denen das zweite Q fehlt, die aber ein N an Position 1 haben (Regex: ([az]{22,})(N.{5}QG{9,})). In einem dritten Schritt haben wir auch längere, degenerierte Motive X(AIVLSTG)X(IVLQTA)xQxGx9 einbezogen, für die wir den folgenden regulären Ausdruck verwendet haben: ([az]{22,})(..[AIVLSTG].[IVLQTA]. QG{9,}). Alle extrahierten Curlin-Wiederholungssequenzen wurden in einem einzigen Multi-Fasta zusammengestellt und Sequenzlogos wurden mit Weblogo 3 (http://weblogo. threeplusone.com/create.cgi) erstellt.

Für die Analyse von CsgB-Sequenzen haben wir alle eindeutigen Sequenzen aus der RefSeq-Datenbank mit der Anmerkung CsgB oder Minor Curlin abgerufen, ihre Signalsequenz über Signalp640 entfernt, die Datensatzredundanz auf <90 % paarweise Sequenzähnlichkeit heruntergefiltert und alle Teileinträge entfernt. Um das globale Alignment und die MSA-Erzeugung zu erleichtern, haben wir unsere Analyse auf CsgB-Varianten mit einer ähnlichen Anzahl von Curlin-Wiederholungen beschränkt (d. h. 5 Wiederholungen, was Sequenzlängen zwischen 100 und 160 Aminosäuren übersetzt, um variable Längen der N22-Region am N zu ermöglichen -Terminus).

Die Batch-Prognose der Proteinstruktur des Homologdatensatzes wurde mithilfe der localcolabfold-Implementierung30,31,32 (https://github.com/YoshitakaMo/localcolabfold) von AlphaFold2 mit einem Toleranzwert von 0,5 durchgeführt, wobei 6 Recyclingvorgänge durchgeführt wurden und 5 Modelle ausgegeben wurden. Die Modelle wurden anhand des pLDDT-Scores eingestuft. Modelle entsprechend Abb. 2a, b und 3 wurden mit dem Jupyter-Notebook AlphaFold2_advanced.ipynb unter https://github.com/sokrypton/ColabFold unter Verwendung von Jackhmmer49, einem Toleranzwert von 0,1, 24 Recyclings und der Ausgabe von 5 Modellen sowie unter Beibehaltung der am besten bewerteten Modelle erstellt. Für multimere Vorhersagen wurden Primärsequenzen verschiedener Untereinheiten verkettet und durch ein „/“ getrennt.

CsgA (P28307) und R15.5 (A0A0E3UX01) wurden über die NdeI-Stelle ohne ihre Signalsequenz, aber mit einem C-terminalen Tag 6xHis-Tag in pET22b kloniert. Die Expression wurde in BL21(DE3) ΔslyD-Zellen durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert, nachdem eine OD600nm von 0,6 erreicht wurde. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 g nach einer Stunde Induktion geerntet. Die Pellets wurden 30 Minuten lang in Puffer A (50 mM Kpi pH 7,2, 500 mM NaCl, 8 M Harnstoff, 12,5 mM Imidazol) lysiert und das Zelllysat 30 Minuten lang bei 20 °C und 40.000 g zentrifugiert. Nach der Ultraschallbehandlung zur Reduzierung der Viskosität des Lysats wurde der Überstand auf eine HisTrapTM FF-Säule (GE Heathcare Life Sciences) geladen, die mit 5 Säulenvolumina (CV) Puffer A äquilibriert war. Nach dem Waschen in 10 CV Puffer A wurde das Protein mit eluiert Puffer B (50 mM Kpi pH 7,2, 8 M Gnd HCl, 250 mM Imidazol). Relevante Proteinfraktionen wurden gepoolt und mit einem 0,22-µm-Cutoff-Filter gefiltert, um mögliche Amyloidkeime zu entfernen, und bei –80 °C gelagert.

Um eine unerwünschte Amyloidbildung in unseren Proteinstammlösungen zu verhindern, wurden alle Reinigungsschritte unter denaturierenden Bedingungen (8 M Harnstoff) durchgeführt und die Handhabungszeiten bei Raumtemperatur auf ein absolutes Minimum reduziert. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, CsgA und R15.5 in ihrer ungefalteten Prä-Amyloid-Form zu speichern und ermöglicht die Kontrolle über den genauen Startpunkt der Polymerisation durch Pufferumschaltung auf native Bedingungen, d. h. 15 mM MES pH 6,0. Zur Entfernung von Harnstoff wurden ZebaTM Spin-Entsalzungssäulen (7 K MWCO) (Thermo Scientific) oder 5 ml HiTrap-Entsalzungssäulen (GE Healthcare) verwendet.

Die Negativfärbungs-TEM-Bildgebung (nsTEM) von R15.5-Filamenten erfolgte unter Verwendung von mit Formvar/Kohlenstoff beschichteten Kupfergittern (Electron Microscopy Sciences) mit einem 400-Loch-Netz. Die Gitter wurden 45 s lang mit einem Plasmastrom von 4 mA glimmentladen (ELMO; Agar Scientific). 3 µl der in vitro zusammengesetzten R15.5-Filamentlösung wurden auf die glimmentladenen Gitter aufgetragen und 1 Minute lang adsorbieren gelassen. Die Lösung wurde trocken geblottet, gefolgt von drei Waschgängen mit 15 µl Milli-Q. Danach wurden die Gitter dreimal für 10 s, 2 s und 1 Minute in 15-µl-Tropfen von 2 % Uranylacetat getaucht, mit einem Blotting-Schritt zwischen jedem Eintauchen. Der überschüssige Fleck wurde dann mit Whatman-Papier vom Typ 1 trocken abgetupft. Alle Gitter wurden mit einem 120-kV-JEOL-1400-Mikroskop untersucht, das mit einem LaB6-Filament und einer TVIPS-F416-CCD-Kamera ausgestattet war.

Um eine experimentelle Validierung der zweizähligen Schraubenachse in der Untereinheitsschnittstelle zu erreichen, haben wir doppelte Cysteinmutanten mit einem oberflächenlokalisierten Cys im N- (R1: S10C oder D21C) und C-Terminus (R14: T342C) hergestellt, so dass sie es sind nebeneinander und innerhalb des Disulfidbindungsabstands (CsgA S10C/T342C) oder auf gegenüberliegenden Seiten der Grenzfläche (CsgA D21C/T342C) der R15.5-Schraubenachse (ergänzende Abbildung 8a). 100 ng gereinigte in vitro produzierte Fasern von WT CsgA, CsgA S10C/T342C und CsgA D21C/T342C sowie eine einzelne Cysteinmutante von CsgBCys am C-Terminus (X00C, als 100 % Markierungskontrolle), alle in 50 mM Kalium Phosphat pH 7,2, 8 M Harnstoff, 250 mM Imidazolpuffer, wurden in Lösung mit IRDye680-Maleimid zur Reaktion gebracht (Raumtemperatur 1 Stunde), um freie Thiole zu markieren. Die Fasern wurden vor dem Auftragen (durch Filtration, um die Fasern zurückzuhalten) auf eine Nitrozellulosemembran und der Bestimmung des 680-nm-Fluoreszenzsignals (mit Licor Odyssey M) zweimal in PBS gewaschen. Die Markierungseffizienz wird als Fluoreszenzsignal angegeben, das auf das des nicht-oxidierenden einzelnen Cys-Mutanten CsgBCys normiert ist.

Hochauflösende Kryo-EM-Datensätze wurden mit hauseigenen, mit Graphenoxid (GO) beschichteten Quantifoil™ R2/1 300 Kupfermaschen-Lochkohlenstoffgittern gesammelt. Für die GO-Beschichtung wurden die Gitter 1 Minute lang in einem Glühentlader von ELMO (Agar Scientific) bei 5 mA Plasmastrom glimmentladen. Zur Vorbereitung der Kryoproben wurde ein Gatan CP3 Kryokolben verwendet, der auf –176 °C und eine relative Luftfeuchtigkeit von 90 % eingestellt war. Insgesamt 3 µL Amyloidlösung wurden auf das Lochgitter aufgetragen und 30 s lang inkubiert. Die Lösung wurde von beiden Seiten mit Whatman-Papier vom Typ 2 3 s lang mit einer Blotkraft von 0 trocken abgetupft und in vorgekühltem flüssigem Ethan bei –176 °C tauchgefroren. Hochauflösende Kryo-EM-2D-Mikrofotografiefilme wurden bei 300 kV auf einem JEOL Cryoarm300-Mikroskop aufgenommen, das mit einem Ω-Energiefilter in der Säule (betrieben bei einer Spaltbreite von 20 eV) ausgestattet war und mit SerialEM 3.0.850 automatisiert wurde. Die Filme wurden mit einem K3-Direktelektronendetektor im Zählmodus bei einer Vergrößerung von 60k mit einer kalibrierten Pixelgröße von 0,764 Å/Pixel und einer Belichtung von 64,66 e/Å2 über 61 Bilder aufgenommen. Insgesamt wurden 3960 bzw. 4455 Filme in einem Defokusbereich von 0,5 bis 3,5 Mikrometern für Ex-vivo-Curli bzw. R15,5 gesammelt.

Alle dosisfraktionierten Filme wurden mit MOTIONCORR2 (Zheng et al., 2017), implementiert in RELION 3.1 (Zivanov, Nakane & Scheres, 2020), auf strahlinduzierte Bewegung korrigiert. Die Kontrastübertragungsfunktion (CTF) der bewegungskorrigierten Bilder wurde mit CTFFIND4 berechnet (Rohou & Grigorieff, 2015). 1000 Filamente wurden manuell mit e2helixboxer.py des EMAN2-Pakets verpackt (Tang et al., 2007) und als Trainingsdatensatz für SPHIRE-crYOLO verwendet. Das crYOLO-Modell wurde dann zur automatischen Auswahl der Filamentkoordinaten in allen Datensätzen verwendet. Filamentpartikel der Kastengröße 300 × 300 Pixel wurden mit einer Überlappung von 10 % in RELION extrahiert. Nach der Extraktion wurden 341691 bzw. 1817890 Partikel für Ex-vivo-Curli und R15.5 erhalten. Um nicht ideale Partikel herauszufiltern, wurden in RELION 4.0 mehrere Runden der 2D-Klassifizierung mit einem Regularisierungsparameter T-Wert von 10 ausgeführt, wobei jeder Lauf aus 50 Iterationen bestand. Mehrere Filterrunden führten zu Datensätzen mit 41.806 bzw. 243.391 angereicherten Partikeln von Ex-vivo-Curli bzw. R15.5. Keiner der resultierenden 2D-Klassendurchschnitte zeigte irgendwelche Anzeichen einer helikalen Natur, wie anhand der Peaks der Fourier-Transformation der Filamentbilder beurteilt wurde. Um das 3D-Volumen zu generieren, wurden drei Runden von 3D-Klassifizierungen durchgeführt (ergänzende Abbildung 16). Für den ersten Durchlauf wurde als Ausgangsmodell ein konturloser Zylinder von 4 nm verwendet. Die 3D-Klassifizierung wurde mit aktivierter Spiralrekonstruktion (mit Anstieg des Spiralparameters = 72 Å und Drehung = 180 Grad) durchgeführt, wobei der Regularisierungsparameter T und die Anzahl der Klassen auf 25 bzw. 3 eingestellt waren. Dies führte dazu, dass 73,5 % der Partikel der Klasse 1 zugeordnet wurden. Daher wurde das entsprechende Volumen auf 20 Å tiefpassgefiltert und als Ausgangsmodell für die zweite Runde der 3D-Klassifizierung verwendet, wobei die Parameter auf die gleichen wie in Runde eins eingestellt wurden. Das führte zu drei 3D-Klassen, die jeweils aus 66,6 %, 20,2 % und 13,7 % Partikeln bestanden. Das Volumen, das 66,6 % der Partikel darstellt, wurde als Ausgangsmodell für eine weitere Runde der 3D-Klassifizierung verwendet, wobei der Regularisierungsparameter T auf 50 eingestellt war, jedoch ohne Anwendung einer helikalen Symmetrie. In diesem Schritt enthielten die resultierenden Karten einen Stapel von β-Strängen, die in allen drei Klassen jeweils einen Abstand von 4,7 Å hatten. Von den resultierenden 3D-Klassen stellte Klasse 3 mit 49,2 % der ihr zugeordneten Partikel die größte Gruppe dar, allerdings war das resultierende Volumen in seinem Primärkettengerüst verrauschter und diskontinuierlicher. Im Gegensatz dazu wies Klasse 1 mit 26,3 % Partikeln eine deutlich bessere Primärketten-Rückgratkonnektivität auf. Keine der Klassen führte zu Karten mit genau definiertem Seitenkettenelektronenpotential. Anschließend haben wir 64138 Partikel der Klasse 1 neu zentriert und erneut extrahiert und das entsprechende tiefpassgefilterte Volumen als erstes Modell für die 3D-Verfeinerung verwendet. Obwohl dies fehlerfrei verlief, führte die 3D-Verfeinerung nicht zu einer großen Verbesserung der Kartenqualität. Das von AF2 vorhergesagte Modell von R15.5 wurde dann manuell in der verfeinerten Karte platziert und einer Starrkörperanpassung in ChimeraX unterzogen. Karten- und Modellstatistiken finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Die Hochgeschwindigkeits-AFM-Bildgebung wurde im Tapping-Modus mit einem Nanowizard III AFM (JPK Instruments AG) durchgeführt, das mit einem Hochgeschwindigkeits-AFM-Kopf (Version JPK-00178-H-12-0021) ausgestattet war. Als Substrat für die Bildgebung verwenden wir 10-mm-Muskovitscheiben (AFM-Glimmerscheiben V1 Agar Scientific), die mit Zweikomponenten-Epoxidkleber auf einen Glasträger geklebt sind. Vor dem Laden der Probe (10 µM R15,5 in 15 mM MES pH 6,0 und 1 mM CaCl2) wurde der Glimmer mit Klebeband gespalten. Es wurden Siliziumnitridspitzen (DNP-S10) mit einem nominalen Spitzenradius von 10 nm und einer Federkonstante von 0,06 N/m verwendet. Der Probenansatz wurde in Luft durchgeführt, um die Verzögerung zwischen der CsgA-Injektion und dem Beginn der Bildgebung zu minimieren. Um die beim Scannen auf die Probe ausgeübte Kraft zu minimieren und etwaigen Abweichungen im System entgegenzuwirken, wurde die Sollspannung kontinuierlich auf den niedrigsten Wert eingestellt, bei dem der Kontakt zwischen Spitze und Probe aufrechterhalten wurde.

Um die Aggregationskinetik von R15.5 zu untersuchen, wurde die Signalintensität von 1D-1H-NMR-Spektren von 100 µM ungefalteten R15.5-Monomeren über die Zeit verfolgt (d. h. die Konzentration des Prä-Amyloid-Monomers untersucht), beginnend nach frischer Entsalzung von 50 mM Kaliumphosphat, 250 mM Imidazol, 8 M Harnstoff, pH 7,5 zu McIlvaine-Puffer (Citrat-Phosphat-Puffer) bei verschiedenen pH-Werten (4,0 bis 8,0). Die 1D-1H-Spektren wurden alle 10 Minuten über die Gesamtdauer von 10 Stunden bei 298 K auf einem Bruker Avance III HD 800 MHz-Spektrometer aufgezeichnet, das zur Erhöhung der Empfindlichkeit mit einer TCI-Kryosonde ausgestattet war. Die Wasserunterdrückung wurde durch Gradientenanregungsformung (zgesgp-Pulssequenz) erreicht. Die Probe enthielt 6 % D2O für die Sperre. Die NMR-Daten wurden in TopSpin 3.6 (Bruker) erfasst, verarbeitet und analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die im Haupttext diskutierten AF2-Vorhersagen, Abb. 2 und 3 werden als ergänzende Daten zu dieser Arbeit bereitgestellt. Das molekulare Modell für CsgA R15.5 wurde in der Proteindatenbank unter dem Zugangscode 8C50 [https://doi.org/10.2210/pdb8C50/pdb] hinterlegt. Das verfeinerte Kryo-EM-Volumen wurde bei der EMDB unter dem Zugangscode EMD-16431 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Weitere Daten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Marcus Fislage und Dirk Reiter von der VIB-VUB Facility for Bio Electron Cryogenic Microscopy (BECM) und für ihre Unterstützung bei der Datenerfassung. Wir danken Jolyon Claridge für seine Unterstützung beim Genom-Mining. Diese Arbeit wurde von VIB, dem EOS Excellence in Research Program der FWO, durch die Zuschüsse G0G0818N an HR und G043021N an MS finanziert

Strukturbiologie Brüssel, Vrije Universiteit Brussel, Brüssel, Belgien

Mike Sleutel, Brajabandhu Pradhan, Alexander N. Volkov und Han Remaut

Strukturelle und molekulare Mikrobiologie, VIB-VUB Zentrum für Strukturbiologie, Brüssel, Belgien

Mike Sleutel, Brajabandhu Pradhan und Han Remaut

Jean Jeener NMR Center, Brüssel, Belgien

Alexander N. Volkov

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MS und HR haben das Projekt entworfen und das Manuskript geschrieben. ANV führte 1D H NMR durch. MS, BP und HR trugen zum kryogenen Einfrieren, der KryoEM-Bildgebung und der Datenverarbeitung bei.

Korrespondenz mit Mike Sleutel oder Han Remaut.

Die Autoren erklären, kein konkurrierendes Interesse zu haben.

Nature Communications dankt Hao-Bo Guo und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Sleutel, M., Pradhan, B., Volkov, AN et al. Strukturanalyse und Architekturprinzipien der bakteriellen Amyloid-Curli. Nat Commun 14, 2822 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38204-2

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Eingegangen: 23. Juni 2022

Angenommen: 20. April 2023

Veröffentlicht: 17. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38204-2

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