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Aug 28, 2023

Quantitatives Bild

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 6384 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die neuartigen gezielten Therapeutika gegen das Hepatitis-C-Virus (HCV) im letzten Jahrzehnt konnten den größten Teil des klinischen Bedarfs für diese Krankheit decken. Trotz antiviraler Therapien, die zu einer anhaltenden virologischen Reaktion (SVR) führen, bleibt jedoch eine Herausforderung bestehen, wenn das Stadium der Leberfibrose bei einigen Patienten unverändert bleibt oder sich sogar verschlechtert und ein höheres Risiko für eine Leberzirrhose besteht, die sogenannte irreversible Gruppe. In dieser Studie lieferten wir neuartige Einblicke in die Kollagenstruktur auf Gewebeebene für die frühzeitige Vorhersage irreversibler Fälle mittels bildbasierter Computeranalyse mit einer gepaarten Datenkohorte (aus Prä- und Post-SVR) nach direkt wirkender antiviraler (DAA)-basierter Behandlung. Zur Bildgebung gepaarter Biopsien von 57 HCV-Patienten wurden Zwei-Photonen-Anregung und Mikroskopie der zweiten Harmonischen eingesetzt und eine vollautomatische Plattform zur digitalen Kollagenprofilierung entwickelt. Insgesamt wurden 41 auf digitalen Bildern basierende Merkmale profiliert, wobei festgestellt wurde, dass vier Schlüsselmerkmale stark mit der Reversibilität der Fibrose zusammenhängen. Die Daten wurden auf ihren prognostischen Wert validiert, indem Prototypen von Vorhersagemodellen erstellt wurden, die auf zwei ausgewählten Merkmalen basierten: Kollagenflächenverhältnis und Kollagenfasergeradheit. Wir kamen zu dem Schluss, dass das Kollagenaggregationsmuster und die Kollagendicke starke Indikatoren für die Reversibilität der Leberfibrose sind. Diese Ergebnisse zeigen die potenziellen Auswirkungen der Kollagenstrukturmerkmale einer DAA-basierten Behandlung auf und ebnen den Weg für eine umfassendere frühe Vorhersage der Reversibilität unter Verwendung von Biopsieproben vor der SVR, um rechtzeitige medizinische Interventionen und Therapiestrategien zu verbessern. Unsere Erkenntnisse zur DAA-basierten Behandlung tragen darüber hinaus zum Verständnis des grundlegenden Steuerungsmechanismus und der Wissensbasis der strukturellen Morphologie bei, auf der die zukünftige nicht-invasive Vorhersagelösung aufbauen kann.

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sind weltweit etwa 58 Millionen Patienten mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert, wobei schätzungsweise 1,5 Millionen Neuinfektionen pro Jahr auftreten. Ungefähr 20–30 % aller HCV-Patienten entwickeln eine fortgeschrittene Leberfibrose oder Zirrhose1. Leberzirrhose ist die vierthäufigste Ursache chronischer Erkrankungen und führt jährlich zu etwa 1 Million Todesfällen2. Neben der Leberdekompensation infolge einer Leberzirrhose ist das hepatozelluläre Karzinom (HCC) die andere gefürchtete Folge. Etwa 2–7 % der Patienten mit Leberzirrhose entwickeln jährlich ein HCC, verglichen mit 7/100.000 in der gesunden Bevölkerung.

Zu den traditionellen Behandlungsoptionen für HCV gehören Peginterferon, Ribavirin und Harvoni, die mit einer Umkehrung der Leberfibrose verbunden sind3. Zu den in den letzten Jahren von der FDA zugelassenen neuartigen HCV-Therapeutika gehören Epclusa® (Sofosbuvir) und OLYSIO® (Simeprevir)4,5,6. Obwohl direkt wirkende antivirale Wirkstoffe (DAAs) eine hohe Rate an anhaltender virologischer Reaktion (SVR) verzeichnen, bei der 24 Wochen nach Abschluss der antiviralen Therapie kein HCV mehr im Blutplasma nachgewiesen wird6, wurden etwa 30 % der Fälle gemeldet bei denen sich die Fibrose nach SVR7 nicht verbessert hat, was wir als die in Abb. 1A gezeigte irreversible Gruppe klassifizieren. Der Prozess der Leberfibrogenese ist komplex und umfasst viele Akteure. Hepatische Sternzellen (HSCs) spielen bekanntermaßen eine zentrale Rolle8,9,10. Tumornekrosefaktor α (TNF-α)11, transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β)12,13,14,15, IL-1116,17 und OSM18,19 sind einige der bekannten Zytokine, die an den Fibrogenesewegen beteiligt sind. Immunzellen wie NK-Zellen haben antifibrotische Eigenschaften und sind auch mit der Reversibilität der Fibrose verbunden20. Eine aktuelle Arbeit ergab, dass neben Entzündungen und der Immunantwort auch die Angiogenese eine Schlüsselrolle spielen könnte21. Der Umbau des Stroma-Kollagens erfolgt mit einer Neuausrichtung des Kollagens im Leberparenchym22,23,24. Mehrere Studien zeigten, dass die Verringerung der fibrösen Narbe und die Inaktivierung der Apoptose von Myofibroblasten auch mit einer Fibroseregression verbunden sind25,26,27,28. Obwohl die oben genannten Mechanismen erforscht wurden, fehlt in der Literatur die Rolle des strukturellen Umbaus von Kollagen bei der Fibrosereversibilität. Biopsieschnitte sind immer noch der Goldstandard, um die strukturelle Morphologie auf Gewebeebene aufzudecken und einen immensen Informationsschatz für die zukünftige Forschung bereitzustellen. Es gibt einige Debatten über die Notwendigkeit einer Biopsieprobenahme angesichts der Genauigkeit nicht-invasiver Techniken, während die große Menge an Informationen, die aus Biopsien verfügbar sind, unbestreitbar wertvoll ist, um zukünftige nicht-invasive Lösungen weiter zu verbessern.

Die Vorhersage der HCV-induzierten Leberfibrose-Reversibilität nach SVR hat einen erheblichen klinischen Wert. (A) Vor und nach der SVR wurden Leberbiopsien von HCV-Patienten entnommen, damit Pathologen die Reversibilität der Fibrose beurteilen konnten. Derzeit fehlen uns effiziente Prognosefunktionen, die die Patienten für die geeigneten Interventionen stratifizieren können. (B) Leberbiopsiebilder wurden mit TPE- und SHG-Techniken gescannt und dann mit internen Rechenalgorithmen verarbeitet. Die Merkmale wurden ausgewählt, um einen Prototyp eines Vorhersagemodells zur Klassifizierung der Patienten zu erstellen. (C) Das gewünschte Vorhersagemodell stratifiziert die Patienten entweder als irreversibel oder reversibel und gibt an, welche Patienten entlassen, für nicht-invasive Nachuntersuchungen behalten oder in eine klinische Studie aufgenommen werden können.

In unserer Studie wurde sowohl vor als auch nach der Behandlung eine Leberbiopsie durchgeführt, damit der Arzt beurteilen konnte, ob der Grad der Fibrose nach der Behandlung zurückgegangen ist oder nicht, wie in Abb. 1A dargestellt. Um die Wahrscheinlichkeit einer Fibrosereversibilität bei Patienten nach SVR vorherzusagen, besteht Bedarf an einer kombinierten quantitativ-qualitativen Lösung zur Auswahl der Kollagenmerkmale, um sie in der Klinik für optimierte medizinische Eingriffe zu stratifizieren, wie in Abb. 1B, C dargestellt . Das Fehlen prädiktiver Merkmale für die Reversibilität der HCV-induzierten Leberfibrose ist hauptsächlich auf die bisherigen bildgebenden technischen Einschränkungen zurückzuführen. Der Umbau und die Quantifizierung von Kollagen wurden in der Vergangenheit mithilfe biochemischer Färbungen wie Picrosirius Red (PSR) oder Masson Trichrome (MT) untersucht. Diese Analyse hängt jedoch stark vom Färbeprotokoll und den Farbentfaltungsalgorithmen ab, wodurch deren Konsistenz eingeschränkt wird. Solche Methoden sind nicht in der Lage, prädiktive Merkmale der HCV-induzierten Leberfibrose-Reversibilität zu identifizieren, und stattdessen wird normalerweise nur die Gesamtmenge an Kollagen in Gewebeproben ermittelt, die als Collagen Proportion Ratio (CPR) bezeichnet wird. Daher sind die quantitativen Strukturinformationen der Kollagenfasern nach wie vor unzureichend für eine tiefergehende Analyse, die einen Vorhersagewert für die Ergebnisse der Fibrosereversibilität liefern könnte.

Während Strukturinformationen von Kollagen mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren oder Protokollen nicht leicht zugänglich sind, sind sie von zentraler Bedeutung, um mehr Einblicke in den Mechanismus der Reversibilität der Leberfibrose zu gewinnen. Jüngste Fortschritte in den medizinischen Bildgebungstechniken, dem Two-Photon Excitation (TPE) und dem Second Harmonic Generation (SHG) Bildgebungssystem, ermöglichen es uns, die Kollagenstrukturen detaillierter zu erfassen und zu quantifizieren. SHG ist eine laserbasierte, quantitative nichtlineare optische Bildgebungstechnik mit mehreren Photonen, die zur Identifizierung von fibrillärem Kollagen in fleckenfreiem, formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebe verwendet wird. Aufgrund seiner physikalischen Wirkprinzipien reagiert es sehr empfindlich auf Veränderungen der Kollagenfibrille, der Faserstruktur und des Umbaus des Bindegewebes. Über die Anwendung dieser neuen Bildtechnik bei der Diagnose29,30,31,32,33,34,35,36 und Prognose37,38 des Hepatitis-B-Virus (HBV) und HCV wurde sowohl an Tiermodellen als auch an menschlichen klinischen Proben berichtet.

Die Arzneimittelentwicklung neuer antifibrotischer Medikamente wird auf einer genauen, zuverlässigen und quantitativen Bewertung der Leberfibrose basieren8,24. Ungefähr acht verschiedene antihepatische Fibroseverbindungen befinden sich in verschiedenen Stadien klinischer Studien in der Entwicklung und Validierung. Es gibt jedoch noch keine wirksamen, von der FDA zugelassenen Medikamente, um das Fortschreiten der Leberfibrose zu verhindern. Nach der wirksamen antiviralen Behandlung von HCV besteht der nächste wesentliche Bedarf darin, Patienten mit reversibler oder irreversibler Leberfibrose vorherzusagen, um eine genauere aktive Überwachung und Aufnahme in geeignete laufende klinische Studien zu ermöglichen, wie in Abb. 1C dargestellt.

In dieser Studie haben wir bildbasierte quantitative Prognosemerkmale identifiziert und diese verwendet, um das Risiko einer Fibrosereversibilität bei Patienten, die durch HCV nach SVR verursacht werden, vorherzusagen. Wir haben eine neuartige Rechenlösung bereitgestellt, um Kollagen basierend auf der Intensität und Morphologie des Faser-SHG-Signals in zwei verschiedene Modi zu kategorisieren: Aggregated Thick Collagen (ATC) und Dispersed Thin Collagen (DTC) (Abb. 2A, B). Die Unterscheidung von ATC und DTC bietet einen einzigartigen Einblick in den Kollagenumbau während des Fortschreitens der Leberfibrose. Unter Verwendung von TPE- und SHG-Bildgebungstechniken verwendeten wir auch eine vollautomatische Plattform zur digitalen Kollagenprofilierung, die in einer früheren Studie39 entwickelt wurde, um Kollagenstrukturen anhand von vier Merkmalskategorien zu quantifizieren: Intensität/Fläche, Textur, Struktur und Faserverteilungsmerkmale. Schließlich nutzten wir unsere Daten, um die allgemeinen Prozesse abzuleiten, die der Reversibilität der Fibrose zugrunde liegen könnten.

Quantitative Kollagenstrukturmerkmale, extrahiert aus der automatischen Bildanalyse. (A) Repräsentative TPE- (rot) und SHG-Bilder (grün), die die Kollagenstrukturen angeben. Das Kollagen hat zwei unterschiedliche Modelle: aggregiertes dickes Kollagen (ATC) und verteiltes dünnes Kollagen (DTC). Der ATC-Bereich enthält hochkonzentrierte und aggregierte Kollagenfasern, wie durch den gelben Pfeil angezeigt. Das Kollagen im DTC-Bereich ist gleichmäßig und dünn verteilt, wie der weiße Pfeil zeigt. Das blaue Kästchen gibt den in Teilen dargestellten Bereich an (C–E). (B) Unser auf Intensitätsmorphologie basierender Filter ist in der Lage, diese beiden Arten von Regionen erfolgreich zu unterscheiden, wie der gelbe und weiße Pfeil zeigt. (C) Das Kollagensignal wird mithilfe eines GMM-Modells erkannt und ihre Konnektivität bleibt für eine bessere strukturelle Beschreibung erhalten. (D) Auf das Kollagen-Binärbild wurde eine Skelettierung angewendet, um die Mittellinie des Fasernetzwerks zu identifizieren. (E) Ähnliche Lösungen werden auf den TPE-Kanal angewendet und wir extrahieren die Funktionen entsprechend aus TPE. (F) Darstellung der Kollagenfaserlänge (CFL). (G) Darstellung der Kollagenfaserdicke (CFT). (H) Erkennung von Verbindungspunkten (gelbe Punkte) zur Messung der Komplexität des Kollagennetzwerks.

Insgesamt wurden 114 Bilder von gepaarten Biopsien vor und nach der SVR von 57 Patienten gesammelt. Von den ursprünglich 64 Teilnehmern wurden sechs aufgrund unvollständiger Angaben disqualifiziert. Ein weiterer Patient wurde aufgrund einer Mutation des Virusgenotyps und des Fehlens von SVR ausgeschlossen. Klinische Blutanalysen bestätigten, dass alle anderen Patienten eine SVR erreicht hatten und das Virus vollständig ausgerottet hatten. Die 29 männlichen und 28 weiblichen Patienten waren zwischen 18 und 61 Jahre alt (Durchschnittsalter 44,27 ± 10,99 Jahre). Die histologischen Fibrosestadien jedes Patienten sowohl für Biopsien vor als auch nach SVR wurden unabhängig und blind von einer Gruppe von Pathologen unter Verwendung von mit Masson-Trichrom gefärbten Objektträgern nach dem Ishak-Bewertungssystem40 parallel überprüft. Bei der Fibrosebeurteilung von Biopsieproben werden gepaarte Ishak-Scores (prä-SVR und post-SVR) als Referenzstandard vorgelegt. Anschließend wurde der Fibrosestatus jedes Patienten in die folgenden zwei Gruppen eingeteilt: (i) „Reversibel“: Die Fibrose wird umgekehrt, der Ishak-Score wird verringert; und (ii) „irreversibel“: Fibrosegrad und Ishak-Score bleiben gleich oder steigen an.

Laut einer unabhängigen und verblindeten pathologischen Beurteilung des Fibrosestadiums besserten sich 21 Patienten (13 Männer und 8 Frauen) nach der SVR („Reversible“-Gruppe) und 36 Patienten (16 Männer und 20 Frauen) entwickelten die gleiche oder eine Verschlechterung der Fibrose („ Gruppe „Unumkehrbar“).

Es ist eine traditionelle Vereinfachung, den Kollagenumbau als einfache Erhöhung oder Verringerung des gesamten Kollagengehalts zu charakterisieren. Neue Einblicke in die Unterschiede in den Kollagenstrukturen zwischen verschiedenen Regionen sind entscheidend, um den Mechanismus der Reversibilität der Leberfibrose zu verstehen. Aufgrund technischer Einschränkungen wurde der Grad/das Ausmaß der Kollagenaggregation im Rahmen von Fibrosestudien historisch nicht erfasst. Wir haben eine neuartige Rechenlösung bereitgestellt, die auf der Intensität, Textur und Morphologie des Faser-SHG-Signals basiert, um die Kollagenkompartimente in zwei verschiedene Modi zu klassifizieren: Aggregated Thick Collagen (ATC) und Dispersed Thin Collagen (DTC). Die ursprünglichen TPE- (roter Kanal) und SHG-Signale (grüner Kanal) eines repräsentativen Bildes sind in Abb. 2A dargestellt. Der ATC-Bereich ist der Bereich mit hochkonzentrierten und aggregierten Kollagenfasern, der durch den gelben Pfeil in Abb. 2A angezeigt wird. Unsere Klassifizierungslösung ist in der Lage, den ATC-Bereich erfolgreich zu unterscheiden, wie der gelbe Pfeil in Abb. 2B zeigt. Auf der anderen Seite des Bildes ist das Kollagen gleichmäßig und spärlich im DTC-Bereich verteilt, was durch den weißen Pfeil in Abb. 2A,B hervorgehoben ist.

Die extrahierten Merkmale eines kleineren Gewebestücks innerhalb des blauen Quadrats in Abb. 2A werden verstärkt und in Abb. 2C–E dargestellt. Basierend auf dem Zwei-Moden-Gaußschen Mischungsmodell (GMM) ermitteln wir die von den Kollagenen eingenommene Fläche und bewahren ihre in Abb. 2C gezeigte Konnektivität. Das Kollagenflächenverhältnis (CAR) wurde basierend auf dem Verhältnis der roten und blauen Bereiche innerhalb der Fläche des Kollagen-Binärbilds (ATC-Bereich bzw. DTC-Bereiche, Abb. 2B) zur gesamten Kollagenfläche (ATC CAR und DTC CAR) gemessen , jeweils). Im Vergleich zu DTC-Bereichen nimmt das Kollagen in ATC-Bereichen oft proportional mehr Fläche ein, wo Kollagen stärker aggregiert und dichter ist. Nach unseren Daten liegt ATC CAR häufig bei > 80 %, während DTC CAR im Allgemeinen bei < 20 % liegt.

Bei chronischer HCV erfolgt der Fibroseprozess portalbasiert. Es beginnt mit Portalfibrose, periportaler Fibrose, Überbrückungssepten zwischen Portal-Portal-, Portal-Zentral- und Zentral-Zentral-Regionen und schließlich mit Zirrhose. Portaltrakte mit ihrem ursprünglichen nativen Kollagen werden in die meisten oder zumindest viele ATC-Bereiche eingebaut. Auf das Kollagen-Binärbild wurde eine Skelettierung angewendet, um die Mittellinie des Fasernetzwerks zu identifizieren, wie durch die rote durchgezogene Linie in Abb. 2D dargestellt. Ein ähnlicher Ansatz wird auch auf den TPE-Kanal angewendet und die Ergebnisse sind in Abb. 2E dargestellt. Die Strukturmerkmale wie die in Abb. 2F dargestellte Kollagenfaserlänge (CFL) und die in Abb. 2G dargestellte Kollagenfaserdicke (CFT) wurden entsprechend berechnet. Die Verbindungspunkte des Kollagennetzwerks wurden dann als gelbe Punkte in Abb. 2H identifiziert. Die Dichte der Verbindungspunkte quantifiziert die Komplexität der Kollagen- oder Gewebenetzwerke. Supp. Tabelle 1 enthält eine nicht umfassende Liste der wichtigsten Funktionen, die wir extrahiert haben, zusammen mit ihren Definitionen. Ähnlich wie bei ATC CAR und DTC CAR werden alle anderen extrahierten Merkmale innerhalb des ATC-Bereichs und des DTC-Bereichs separat berechnet. Beispielsweise verfügt CFL über ATC CFL und DTC CFL.

Wir führten univariate Analysen zur Merkmalsauswahl basierend auf der T-Test-Auswertung durch, um den prognostischen Wert jedes einzelnen Kollagenmerkmals für die Reversibilität der HCV-Fibrose zu bewerten. Das ATC-Flächenverhältnis ist ein Maß zur Quantifizierung der relativen Menge eines bestimmten Gewebes, das von aggregiertem Kollagen eingenommen wird. Es ist definiert als das Verhältnis zwischen der Fläche des roten Bereichs in Abb. 2B und der gesamten Gewebefläche (die Kombination aus roten und blauen Bereichen). . Das ATC-Flächenverhältnis unterscheidet sich von ATC CAR, da der ATC-Bereich im Allgemeinen nicht vollständig von Kollagenkompartimenten besetzt ist, während ATC CAR nur innerhalb von Kollagenbereichen gemessen wird.

Unsere Daten zeigen, dass das ATC-Flächenverhältnis nahezu keine Korrelation mit den Ishak-Scores für die Biopsien vor und nach SVR in der reversiblen Gruppe aufweist, vorausgesetzt R = 0,152 bzw. R = 0,133 in Supp. Abb. 1A,C. Für die irreversible Gruppe besteht jedoch eine stärkere Korrelation zwischen dem ATC-Flächenverhältnis und den Ishak-Scores der Biopsien vor und nach der SVR bei R = 0,688 bzw. R = 0,477. Abb. 1B,D. Dies weist darauf hin, dass die Kollagenaggregation eine Schlüsselrolle bei der Reversibilität der Fibrose spielt. Obwohl die reversiblen und irreversiblen Fälle nicht die statistische Signifikanz des ATC-Flächenverhältnisses vor der SVR zeigen, weist das ATC-Flächenverhältnis einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den beiden Patientengruppen nach der SVR auf (Abb. 3A). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass SVR das ATC-Flächenverhältnis sowohl in reversiblen als auch in irreversiblen Fällen verringert, in der reversiblen Gruppe jedoch noch deutlicher, was die Ansicht stützt, dass die Kollagenaggregation einer der Schlüsselfaktoren ist, die die Reversibilität der Fibrose beeinflussen.

Bewertung der extrahierten quantitativen Kollagenstrukturmerkmale zwischen der reversiblen und der irreversiblen Patientengruppe. (A) Die statistische Signifikanz wird im ATC-Flächenverhältnis der reversiblen und irreversiblen Gruppen vor der SVR-Behandlung nicht gezeigt. Nach der SVR-Behandlung verringerte sich das ATC-Flächenverhältnis beider Gruppen und es wurde ein signifikanter Unterschied beobachtet. (B) Vier ausgewählte Merkmale mit statistischer Signifikanz, genannt ATC CAR, ATC CFT, ATC TRI und DTC CFS, zwischen reversiblen (grüne Linie) und irreversiblen (rote Linie) Patientengruppen vor der SVR-Behandlung. (C) Die durch diese vier gegebenen Merkmale definierten Profile der reversiblen (grüne Linie) und irreversiblen Gruppen (rote Linie) nach der SVR-Behandlung.

Als nächstes analysierten wir die quantitativen Strukturmerkmale, die aus ATC- und DTC-Regionen extrahiert wurden. Vier Merkmale (ATC CAR, ATC CFT, ATC TRI und DTC CFS) zeigten signifikante Unterschiede im Zusammenhang mit der Reversibilität der HCV-Fibrose (Abb. 3B). Wie in der Abbildung gezeigt, ist das Kollagenflächenverhältnis (CAR) eines der grundlegenden Merkmale zur Messung der Kollagenhäufigkeit im Lebergewebe. Aus praktischer Sicht ist portalbasierte, aggregierte Fibrose mit Septenbildung das charakteristische Muster der Fibrose in chronischen HCV-Lebern; daher war mit einer Änderung des ATC CAR zu rechnen. Im Gegensatz zu NAFLD/NASH-Fällen stellen perisinusoidale und dispergierte Fibrose bei HCV-Fällen jedoch normalerweise kein Problem dar; Daher wurde keine wesentliche Änderung des DTC erwartet. Tatsächlich zeigte ATC CAR einen signifikanten Unterschied zwischen reversiblen und irreversiblen Fällen (p = 0,006) (Abb. 3B), während dies bei DTC CAR nicht der Fall war (Daten nicht gezeigt). Die ATC CAR-Werte korrelieren mit den Ishak-Scores sowohl für reversible (R = 0,509) als auch für irreversible Fälle (R = 0,654) vor SVR (Supp. Abb. 2A, B), während der Korrelationskoeffizient sowohl für reversible als auch für irreversible Gruppen nach der SVR abnimmt -SVR (Supp. Abb. 2C,D). Dies weist darauf hin, dass ATC CAR einen prädiktiven Wert für die Prognose der Reversibilität der Leberfibrose zwischen den beiden Patientengruppen hat. Das Risiko einer Irreversibilität ist höher, wenn ein Patient mehr Kollagen im aggregierten Modus hat, d. h. ATC CAR ist höher.

In den ATC-Regionen ist die Kollagenfaserdicke (ATC CFT), ein Maß für den Umfang jeder Kollagenfaser, im irreversiblen Fall ebenfalls höher als im reversiblen Fall (Abb. 3B) (p = 0,036). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem höheren ATC CAR, der in irreversiblen Fällen gefunden wurde; Es ist intuitiv, dass eine dickere Kollagenfaser tendenziell mehr Fläche einnimmt. Wir konnten bei DTC CAR keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen feststellen; Wir stellten jedoch fest, dass die Kollagenfasern im DTC-Modus gerader sind, d. h. die Geradheit der DTC-Kollagenfasern (DTC CFS) ist in der irreversiblen HCV-Gruppe im Vergleich zur reversiblen Gruppe höher (Abb. 3B) (p = 0,050). Im Allgemeinen weisen dickere Kollagenfasern im ATC-Bereich und geraderes Kollagen im DTC auf eine geringere Wahrscheinlichkeit einer Fibrosereversibilität hin. Dieser strukturelle Unterschied in diesen verschiedenen Kollagenmodi impliziert, dass die Faserpackung in reversiblen und irreversiblen Fällen unterschiedlich ist.

Ein wichtiges Merkmal, das aus dem TPE-Kanal zwischen den beiden Gruppen extrahiert wurde, ist in Abb. 3B dargestellt. Im ATC-Bereich stellten wir fest, dass der Tissue Reticular Index (ATC TRI), ein Maß für die Komplexität der Gewebestruktur, in den Proben der irreversiblen Gruppe deutlich höher ist, was darauf hindeutet, dass Gewebestrukturen in dieser Gruppe ein komplexeres Netzwerk bilden. Der Anstieg des ATC CAR ist mit einem höheren ATC TRI verbunden, obwohl der Mechanismus zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht klar ist. Als nächstes untersuchten wir die Veränderung dieser vier Merkmale nach SVR (Abb. 3C). Nach SVR verlieren ATC TRI und DTC CFS beide ihre Bedeutung; Allerdings wird der Unterschied zwischen ATC CAR und ATC CFT dramatischer, dh der p-Wert verringert sich weiter. Beispielsweise sank der p-Wert von ATC CAR von p = 0,006 auf p = 0,001. Wir kommen zu dem Schluss, dass die reversiblen und irreversiblen Gruppen vor der SVR einen signifikanten Unterschied aufweisen (Abb. 3B) und dass ihre Reaktionen in der Kollagenstruktur nach der SVR ebenfalls unterschiedlich sind (Abb. 3C).

Um die relativen Veränderungen zwischen den beiden Patientengruppen vor und nach der SVR besser zu verstehen, präsentieren wir einen Vergleich unserer Daten in Abb. 4. Obwohl es einige strukturelle Unterschiede für die reversible Gruppe gibt, sind die Unterschiede mit Ausnahme von nicht statistisch signifikant ATC-WAGEN (Abb. 4A). Die kleinen Unterschiede in den vier Merkmalen vor und nach der SVR deuten darauf hin, dass sich die Fibrose der reversiblen Gruppe leicht verbessert und nicht verschlechtert. Die Ergebnisse der irreversiblen Gruppe vor und nach der SVR sind in Abb. 4B dargestellt. Der mit dem ATC CFT gemessene Faserumfang zeigt einen deutlichen Anstiegstrend nach SVR mit klarer Signifikanz. Ein weiteres wichtiges Merkmal für die irreversible Gruppe ist die strukturelle Komplexität, gemessen durch den ATC TRI. Die Abnahme von ATC TRI könnte mit der Zunahme von ATC CFT verbunden sein, da mehr Fläche vom Kollagen eingenommen wird, was zu einem einfacheren Netzwerk des Zellgewebes führen kann, oder umgekehrt. Allerdings konnten wir in der reversiblen Gruppe nicht das gleiche Ergebnis beobachten (Abb. 4A). Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die physiologischen Mechanismen hinter der Abnahme von ATC TRI und der Zunahme von ATC CFT für die irreversible Gruppe zu ermitteln.

Die relativen Veränderungen der Kollagenmerkmale in reversiblen und irreversiblen Patientengruppen vor und nach der SVR. (A) Die Merkmale des reversiblen Patienten wurden leicht verbessert, dh schrumpften von der blauen Linie (vor SVR) zur gelben Linie (nach SVR), insbesondere für ATC CAR, was statistische Signifikanz zeigt. (B) Das Profil der irreversiblen Gruppe unterscheidet sich deutlich von dem der reversiblen Gruppe. Der ATC-CFT stieg und der ATC-TRI sank nach der SVR mit statistischer Signifikanz. Die Abnahme von ATC TRI ist möglicherweise mit der Zunahme von ATC CFT verbunden, da die größere vom Kollagen eingenommene Fläche zu einem einfacheren Netzwerk des Zellgewebes führen könnte. (C) Die absoluten Unterschiede des Profils der reversiblen (grüne Linie) und irreversiblen (rote Linie) Gruppen vor und nach der SVR. (D) Die relativen prozentualen Unterschiede im Profil der reversiblen (grüne Linie) und irreversiblen (rote Linie) Gruppen vor und nach der SVR.

Die absoluten Unterschiede und relativen prozentualen Änderungen dieser vier Merkmale vor und nach der SVR sind in Abb. 4C, D dargestellt. Im Allgemeinen bleiben für die reversible Gruppe alle vier Merkmale gleich oder sind im Vergleich zu ihren Ausgangswerten (schwarze Linie) leicht verbessert, wie durch die grüne Linie in Abb. 4C, D dargestellt, während für die irreversible Gruppe die ATC Die CFT hat deutlich zugenommen, was möglicherweise mit dem unbekannten Mechanismus der Fibrosereversibilität zusammenhängt.

Basierend auf unserer Patientenkohorten- und Kollagenstrukturanalyse zeigen die oben genannten vier quantitativen bildbasierten Kollagenstrukturmerkmale einen vielversprechenden prognostischen Wert der HCV-induzierten Leberfibrose-Reversibilität. Es ist wichtig, die Abhängigkeit der Funktionen zu verstehen und ein optimiertes Vorhersagemodell zu erstellen. Im ATC-Bereich gibt es zwei wesentliche Merkmale: Kollagenflächenverhältnis (ATC CAR) und Kollagenfaserdicke (ATC CFT). Im Allgemeinen weisen höhere ATC CAR- und ATC CFT-Werte auf ein höheres Risiko einer Irreversibilität auch nach SVR hin. Allerdings sind ATC CAR und ATC CFT nicht völlig unabhängig. Wie in Supp gezeigt. In Abb. 3A zeigt die lineare Beziehung zwischen diesen beiden Merkmalen eine starke Korrelation, wie durch die schwarze gepunktete Linie angezeigt. Der Anstieg der ATC-CFT nach der SVR zeigt, dass die Kollagenfasern in der irreversiblen Gruppe dicker wurden, während die ATC-CFT in der reversiblen Gruppe nahezu gleich bleibt. Dies impliziert, dass das Kollagenpackungsmuster in beiden Gruppen unterschiedlich ist. Im DTC-Bereich hat die Kollagenfasergeradheit (DTC CFS) einen signifikanten Vorhersagewert für die Fibrosereversibilität. Die Messung der strukturellen Komplexität (ATC TRI), die auf der Grundlage des Zwei-Photonen-Anregungskanals (TPE) extrahiert wird, ist ebenfalls wichtig, obwohl der Mechanismus weiterer Erforschung bedarf und wir ihn nicht in unser Vorhersagemodell aufgenommen haben, obwohl es sich lohnt, ihn weiter zu untersuchen.

Die drei Kollagenmerkmale, also ATC CAR, ATC CFT und DTC CFS, haben das Potenzial, ein praktisches Vorhersagemodell für den klinischen Einsatz zu erstellen. Basierend auf unseren bisherigen Daten bilden das aggregierte Kollagenflächenverhältnis und die Geradheit der verteilten Fasern (ATC CAR bzw. DTC CFS) die beiden ausgewählten prognostischen Merkmale mit prädiktivem Wert für die Reversibilität der Leberfibrose bei HCV-Patienten, da beide Messwerte im irreversiblen Bereich deutlich höher sind Gruppe.

Die signifikanten statistischen Unterschiede zwischen den ausgewählten Merkmalen von Biopsien vor der SVR ermöglichen es uns, einen Prototyp eines Vorhersagemodells für die Reversibilität der Fibrose zu erstellen. Solche Vorhersagemodelle sind für die klinische Praxis von wesentlicher Bedeutung, um Patienten im Gesundheitssystem zu stratifizieren und geeignete Patientenkandidaten für klinische Studien auszuwählen. Um die Erstellung unseres Vorhersagemodells zu optimieren, haben wir drei verschiedene Methoden verwendet, um ein klinisches Vorhersagemodell für die Reversibilität der HCV-induzierten Leberfibrose zu erstellen: (1) Bayesianisches Modell, (2) Support Vector Machine (SVM) und (3) Relevance Vector Machine (RVM). ).

Um unser Vorhersagemodell zu optimieren, haben wir verschiedene Methoden nach ihrer Leistung und der visualisierten Entscheidungsgrenze im 2D-Feature-Raum bewertet. Die auf SVM- und RVM-Methoden basierenden Modelle werden in Supp vorgestellt. Feigen. 4, 5. Obwohl das SVM-Modell in Supp. In Abb. 5A und C wurde die beste Leistung erzielt. Die komplizierte Entscheidungsgrenze im 2D-Merkmalsraum kann auf eine Überanpassung aufgrund der begrenzten Stichprobenanzahl hinweisen. Das RVM-Modell ist aufgrund seiner geringen Spezifität ebenfalls nicht ideal.

Das optimale Bayes'sche Modell ist in Abb. 5 dargestellt. Daraus geht hervor, dass die 57 Patienten auf der Grundlage von ATC CAR und DTC CFS in zwei Gruppen eingeteilt werden können. In Abb. 5A stellen die grünen Punkte die reversiblen Fälle und die roten Quadrate die irreversiblen Fälle dar. Auch die Anzahl der Patienten mit reversibler und irreversibler Fibrose in jeder Gruppe ist mäßig ausgeglichen, nämlich 21 reversible Fälle gegenüber 36 irreversiblen Fällen. Im Allgemeinen weisen ein höherer ATC CAR-Wert und ein größeres DTC CFS auf eine schlechte Prognose hin, wohingegen ein niedrigerer ATC CAR-Wert und ein geringeres DTC CFS auf eine gute Prognose (dh reversible Fibrose) hinweisen. Die Entscheidungsgrenze mit zwei Merkmalen wird durch die schwarze durchgezogene Linie zwischen der irreversiblen (grau) und der reversiblen (weiß) Domäne in Abb. 5A dargestellt. Abbildung 5B stellt das kontinuierliche Bayes'sche Vorhersagemodell basierend auf ATC CAR und DTC CFS dar. Die rote Fläche zeigt die irreversiblen Gruppen an, während die grüne Fläche die reversiblen Gruppen anzeigt.

Die diskreten und kontinuierlichen Bayes'schen Vorhersagemodelle für die HCV-induzierte Leberfibrose-Reversibilität. (A) Das optimierte diskrete Modell unter Verwendung zweier ausgewählter Features, ATC CAR und DTC CFS, und ihrer Verteilung im 2D-Feature-Raum. (B) Das optimierte kontinuierliche Modell unter Verwendung von ATC CAR und DTC CFS und ihrer Wahrscheinlichkeitsverteilungsfunktion im 2D-Merkmalsraum.

Die Leistungsmetriken des diskreten und kontinuierlichen Modells sind in Tabelle 1 dargestellt. Basierend auf dem diskreten und kontinuierlichen Modell können wir ~ 85 % der irreversiblen Fälle und etwa 62 % der reversiblen Fälle erfolgreich identifizieren. Die ausgewählten quantitativen Merkmale und das Bayes'sche Vorhersagemodell haben einen potenziell hohen klinischen prognostischen Wert für die Vorhersage der Reversibilität einer HCV-induzierten Leberfibrose.

Sicherlich ist eine größere Stichprobe von Patientendaten wünschenswert, um ein Vorhersagemodell weiter zu validieren, das für die unmittelbare klinische Anwendung geeignet ist, während solche gepaarten Leberbiopsieproben wertvoll und selten sind. Die von uns identifizierten Merkmale zeigen vielversprechende Ergebnisse mit begrenzten Daten und wir haben die ausgewählten Merkmale verwendet, um ein Proof-of-Concept-Modell zu entwickeln und drei verschiedene Vorhersagemodelle als Prototypen zu erstellen, um den prognostischen Wert unserer identifizierten Merkmale zu untersuchen. Basierend auf unserer Analyse konnten wir eine Sensitivität von ~ 85 % bei der Stratifizierung irreversibler Fälle mit Leberbiopsie vor der SVR erreichen, indem wir das prototypische Vorhersagemodell verwendeten, wie in Tabelle 1 gezeigt. Das Zwei-Merkmal-Modell ist jedoch für negative Patienten weniger spezifisch , d. h. etwa 62 % der reversiblen Fälle werden erfolgreich erkannt, was mit der Unsicherheit der Pathologiebeurteilung übereinstimmt. Die Stärke der Sicherheit im Vorhersagemodell kann Kliniker zuverlässig über den Grad der erforderlichen Patientenüberwachung informieren und bei Bedarf eine angemessene Frühintervention ermöglichen, da Vorhersagen auf der Grundlage einer einzelnen Biopsie vor der SVR getroffen werden können. Für die wirklich negativen Patienten (reversible Gruppe) können wir die Nachuntersuchungen weiträumiger planen. Reversible Fälle, die mit geringerer Sicherheit identifiziert wurden, können zusammen mit den irreversiblen Fällen für die aktive Überwachung mit nicht-invasiven Techniken als Folgemaßnahme geschichtet werden.

In unserer Studie wurden mehrere Möglichkeiten für weitere Forschung identifiziert. Der signifikante Unterschied der ATC-CFT zwischen prä- und post-SVR lässt darauf schließen, dass das Kollagenpackungsmuster in den beiden Gruppen möglicherweise auch unterschiedlich ist. Möglicherweise ist eine andere Bildgebungsmodalität erforderlich, beispielsweise ein Elektromikroskop (EM), mit höherer Auflösung, um unsere Entdeckung weiter zu bestätigen, während es einige technische Herausforderungen gibt, die Regionen der ATC- und DTC-Regionen in EM-Bildern zu identifizieren. Auch im Bereich der verteilten, dünnen Kollagenschicht (DTC) hat die Geradheit der Kollagenfasern (DTC CFS) einen signifikanten Vorhersagewert für die Reversibilität der Fibrose. In Zukunft lohnt es sich auch, die DNA- und RNA-Variation zwischen diesen beiden Patientengruppen zu untersuchen, um ihre Rolle bei den Kollagenaggregationsmustern und der Packungsstruktur von Kollagen zu verstehen. Die auf dem TPE-Kanal extrahierte Messung der strukturellen Komplexität (ATC TRI) ist ebenfalls wichtig, aber die Ursache für den ATC TRI-Unterschied zwischen den beiden Gruppen ist nicht klar. Daher haben wir unklare Variablen nicht in unser Vorhersagemodell einbezogen. Dies könnte mit dem Anstieg von ATC CFT und dem Kollagenaggregationsmechanismus verbunden sein. Auch die Kausalität und der Mechanismus zwischen der Kollagenaggregation und Gewebestrukturveränderungen müssen weiter erforscht werden.

Anhand der Biopsien vor der SVR und der Grundlage der Fibrosebewertung aus den Biopsien nach der SVR haben wir bewiesen, dass es prinzipiell möglich ist, durch eine größere Studie ein klinisches Vorhersagemodell zu entwickeln. In der reversiblen Gruppe sind alle vier Merkmale in den meisten Fällen nach der SVR leicht verringert. In der irreversiblen Gruppe ist ATC CFT insbesondere das einzige Merkmal, das nach SVR zugenommen hat, was, wie bereits erläutert, auch für die Abnahme von ATC TRI relevant sein könnte. In Kombination mit dem Geradheitsunterschied im DTC-Bereich weist dieses Ergebnis stark darauf hin, dass die Struktur der Kollagenfaserpackung möglicherweise zwischen irreversiblen und reversiblen Fällen unterschiedlich ist. Weitere Untersuchungen zur Anordnung und zum räumlich-zeitlichen Zusammenspiel dieser verschiedenen Strukturen zwischen den beteiligten Signalwegen und Zelltypen könnten der Schlüssel zum Verständnis der regenerativen Reaktion hinter der Fibrosereversibilität sein und möglicherweise zu neuen Zielen für pharmazeutische Behandlungen führen. Die Packungsstruktur der Kollagenfasern hängt möglicherweise auch mit dem Grad der Kollagenaggregation zusammen. Während unser Hauptziel darin bestand, bildbasierte prognostische Merkmale zu identifizieren, die mit der Vorhersage der Fibrosereversibilität verbunden sind, haben unsere Post-SVR-Biopsieanalysen auch neue Wege für die mechanistische Forschung zur Umkehrung der Fibrose aufgezeigt. Bemerkenswert ist, dass ein weiteres klinisches Merkmal, das Alter des Patienten, identifiziert wurde, wie in Supp gezeigt. Abb. 6. Jüngere Patienten haben insgesamt ein geringeres Risiko einer irreversiblen Fibrose. Bei Patienten unter 30 Jahren besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass eine Fibrose reversibel ist, was auf Zellalterung oder Stoffwechselunterschiede zwischen jüngeren und älteren Bevölkerungsgruppen zurückzuführen sein könnte.

Trotz ihrer Nachteile ist die Leberbiopsie immer noch der Goldstandard zur Beurteilung der Leberfibrose. Zu den Hauptnachteilen einer Biopsie in der klinischen Diagnose gehören die Kosten und das potenzielle Risiko für den Patienten. In dieser Hinsicht kann das Zusammentreffen von invasiven und nicht-invasiven Methoden zusammen mit dem sich entwickelnden Bereich der computergestützten Intervention in der medizinischen Bildgebung dazu beitragen, die Probleme zu lindern, mit denen Biopsietechniken konfrontiert sind, wie z. B. Probenfehler. Zu den nicht-invasiven Instrumenten gehören serologische Methoden. Es gibt verschiedene serologische Ansätze mit unterschiedlichen Vor- und Nachteilen; Diese Methoden werden hauptsächlich in Gemeinden und Regionen mit begrenzten medizinischen Ressourcen eingesetzt. Die elastizitätsbasierte Bildgebungstechnik wie Fibroscan hat sich zu einem wirksamen nicht-invasiven Beurteilungsinstrument für Leberfibrose entwickelt; Allerdings werden die Fibroscan-Ergebnisse erheblich durch die Nahrungsaufnahme, Leberentzündung, intrahepatische Cholestase, Leberstauung und Fettlebererkrankung beeinflusst41. Daher ist die Zuverlässigkeit und Genauigkeit dieser Methode bei Patienten mit ausgeprägter Adipositas und Aszites eingeschränkt. Obwohl die oben genannten serologischen Methoden eine gute Leistung beim Ausschluss und/oder bei der Identifizierung von Patienten mit leichter oder schwerer Leberfibrose erbringen, bleibt die Genauigkeit der mittleren Leberfibrose unbefriedigend, was ihre Wirksamkeit als eigenständiger Test einschränkt. Während daher in manchen Fällen eine erste Leberbiopsie vor der SVR unvermeidbar sein kann, kann ein zuverlässiges Vorhersageinstrument, das auf der Grundlage einer einzelnen Biopsie vor der SVR die Reversibilität der Fibrose anzeigen kann, die Notwendigkeit einer zweiten Biopsie nach der SVR erheblich reduzieren – insbesondere in Verbindung mit einer geeigneten nicht-invasiven Probenahmetechnik, die das Vorhersagemodell durch aktive Überwachung ergänzen kann.

Während die Technologie für nicht-invasive Techniken immer effektiver geworden ist, kann keiner dieser Ansätze die Vollständigkeit der Kollagenstrukturinformationen auf Gewebeebene erhalten, die erforderlich sind, um anzuzeigen, ob die beobachtete Fibrose irreversibel oder reversibel ist. Bei solchen Informationen handelt es sich um ungenutzte Informationen, die zukünftige Forscher nutzen könnten, um das nicht-invasive Screening weiter zu verbessern. Unsere Arbeit ergab, dass die Menge der ATC-Komponenten zwischen reversiblen und irreversiblen Patienten unterschiedlich ist. Die Steifheit der ATC-Komponenten in der Leber ist möglicherweise höher als die der DTC-Regionen. Im klinischen Umfeld angewendet könnte eine genaue Biopsie verräterische Gewissheit über den Zustand eines Patienten liefern, wenn Fortschritte bei der Verbesserung der Spezifität erzielt würden. Die Realität ist, dass beide Technologien von der doppelten Entwicklung durch die Weiterentwicklung der anderen profitieren können. Für den Fall, dass zukünftige nicht-invasive Scanlösungen eine bessere räumliche Auflösung und Konsistenz haben, um die unterschiedliche Steifheit verschiedener Teile der Leber zu erkennen, d Anwendung zur Vorhersage des Reversibilitätsrisikos mithilfe nicht-invasiver Screening-Ansätze.

Obwohl die Ergebnisse dieser Arbeit für die Stratifizierung irreversibler Patienten im Gesundheitssystem vielversprechend sind, müssen wir betonen, dass sie noch vorläufig sind und noch nicht anhand einer unabhängigen größeren Kohorte repliziert werden. Es müssen gut konzipierte, starre prospektive klinische Validierungen/Studien durchgeführt werden, um die dringend benötigte Bestätigung der Leistung des Modells vor seiner klinischen Anwendung zu liefern. Da sich mit der Zeit die mit Leberfibrose verbundenen Merkmale entweder verbessern oder verschlechtern, hat die frühzeitige Identifizierung und Einteilung von HCV-Patienten in reversible und irreversible Leberfibrose einen erheblichen klinischen Wert, da beide Gruppen effektiv verwaltet, überwacht und angemessen behandelt werden können, um die klinischen Ergebnisse zu verbessern.

Das Institutional Review Board (IRB) des Volkskrankenhauses der Universität Peking erteilte eine ethische Genehmigung für die Verwendung von Patientenmaterial (IRB-Ref.: 2017PHB133-01). Patienten mit chronischem HCV erhielten 12 oder 24 Wochen lang eine DAA-basierte Behandlung. Von jedem Patienten wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt und die Studie wurde gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt.

Die Studienkohorte bestand aus gepaarten Leberproben von Patienten mit chronischer Hepatitis-C-Virusinfektion, die zwischen März 2014 und Dezember 2016 am Hepatologischen Institut der Universität Peking, Volkskrankenhaus der Universität Peking, aufgenommen wurden. Klinische und pathologische Merkmale wurden aus den Krankenakten der Patienten ermittelt .

Die wichtigsten Einschlusskriterien waren: 20–70 Jahre alt; chronische Hepatitis-C-Infektion mit oder ohne Zirrhose; HCV-RNA-Spiegel > 10.000 IU/ml zu Studienbeginn; erhielten 12 oder 24 Wochen lang eine antivirale Behandlung mit direkt wirkenden antiviralen Wirkstoffen (DAAs); erreichten 24 Wochen nach Abschluss der Behandlung eine anhaltende virologische Reaktion (SVR; sogenannte Heilung einer Hepatitis-C-Virusinfektion). Gepaarte Leberbiopsien wurden sowohl zu Studienbeginn als auch in Woche 24 nach der Behandlung durchgeführt.

Die Ausschlusskriterien waren wie folgt: Koinfektion mit dem Hepatitis-B-Virus oder dem humanen Immundefizienzvirus (HIV); das Vorliegen anderer Formen chronischer Lebererkrankungen (einschließlich alkoholbedingter Lebererkrankungen); dekompensierte Lebererkrankungen (einschließlich Aszites, Varizenblutung oder hepatische Enzephalopathie); Alpha-Fetoprotein > 100 ng/ml oder Kreatinin-Clearance-Rate < 50 ml/min; jeder bösartige Tumor; jegliche Komplikationen, die schwere Herz-, Lungen-, Nieren- oder Gehirnprobleme verursachen; Diabetes; Blut oder andere bemerkenswerte systematische Krankheiten; BMI > 28 kg/m2; schwere neurologische oder psychische Erkrankung; Schwangerschaft; stillende Frauen.

Archivierte formalinfixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) Leberbiopsiegewebeproben wurden von 64 Patienten entnommen, bei denen zwischen 2014 und 2016 am Hepatologischen Institut des Volkskrankenhauses der Universität Peking eine HCV-Infektion diagnostiziert wurde. Klinisch-pathologische Merkmale der Patienten wurden gesammelt und in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Kernbiopsien hatten eine Länge von mindestens 10 mm und einen Durchmesser von 0,84 mm. Für die SHG-Bildgebung wurden ungefärbte, 4–5 μm dicke histologische Schnitte hergestellt und anschließend zur histologischen Beurteilung mit H&E und Masson-Trichrom gefärbt. Es wurde das Ishak-Stufensystem für Fibrose verwendet (Score 0 – keine Fibrose; 1 – fibröse Erweiterung einiger Portalbereiche, mit oder ohne kurze fibröse Septa; 2 – fibröse Expansion der meisten Portalbereiche, mit oder ohne kurze fibröse Septa; 3 – fibröse Expansion von die meisten Portalbereiche mit gelegentlicher Überbrückung von Portal zu Portal; 4 – faserige Ausdehnung der Portalbereiche mit ausgeprägter Überbrückung (Portal zu Portal) sowie Portal zu Zentral; 5 – ausgeprägte Überbrückung mit gelegentlichen Knötchen (unvollständige Zirrhose); und 6 – Zirrhose, wahrscheinlich oder definitiv)40. Alle klinischen und pathologischen Merkmale wurden aus den Krankenakten der Patienten ermittelt, die vor dem Zugriff irreversibel anonymisiert wurden.

Parallel zu den klinischen Behandlungen und der pathologischen Beurteilung wurden die Biopsien vor und nach der SVR (nach 12 Monaten) von 57 Probanden zunächst entparaffiniert und dann mit Histoindex Genesis 200 gescannt. Jedes Bild eines bestimmten Patienten besteht aus mindestens einer vollständigen Biopsie in Abb. 2A dargestellt. Der Genesis-Scanner erfasste das Bild der Kollagenfasern (mit SHG) mithilfe des grünen Kanals und der Gewebestruktur (mit TPE) mithilfe des roten Kanals, beide mit 8-Bit-Intensität und 20-facher Objektivvergrößerung. Die Laserleistung des Systems wurde auf „Hoch“ und das Binning auf zwei Frames eingestellt, um das zufällige Rauschen zu reduzieren. Die Helligkeit jedes Pixels repräsentiert die Kollagendichte in den Fasern. Das Bildgebungsprotokoll bleibt während unserer Studie konsistent, um eine quantitative Bildaufnahme sicherzustellen.

Diese erfassten Bilder wurden zwischen Januar 2018 und Dezember 2020 mithilfe unserer entwickelten Pipeline für die rechnergestützte Bildanalyse verarbeitet. Jedes anonyme Bild einer bestimmten Biopsie wurde entsprechend seiner anonymisierten pathologischen Identifizierung im Zusammenhang mit klinisch-pathologischen Merkmalen benannt. Zunächst wird der Gaußsche Glättungsfilter angewendet, um den SHG-Kanal vorzuverarbeiten. Anschließend wurde eine Probenmaske definiert, um den vom Lebergewebe eingenommenen Bereich abzudecken. Als nächstes wird das Kollagensignal aus fünf zufälligen Bild-ROIs jedes gegebenen Bildes extrahiert. Der Signalwert in Pixel wird verwendet, um das Kollagensignalklassifizierungsmodell mithilfe eines Erwartungsmaximierungsalgorithmus (EM) wie folgt zu erstellen: (i) Eine zufällige anfängliche Schätzung für die Merkmale des Modells wird aus der „erwarteten“ Verteilung (Trainingsdatensatz) erstellt. typischerweise als E-Schritt bekannt; (ii) Die Wahrscheinlichkeitsverteilung aus dem E-Schritt wird angepasst, um den neuen Datensatz einzuschließen, der normalerweise als M-Schritt bezeichnet wird. (iii) Geschätzte Merkmale können immer dann erhalten werden, wenn sich die Verteilung nicht von E-Schritt zu M-Schritt ändert. Das Zwei-Moden-Gaußsche Mischungsmodell (GMM) wurde angewendet, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Pixelsignal positiv für Kollagen ist. Basierend auf dem GMM-Modell wurde ein optimierter Schwellenwert ermittelt, um das Bild zu binarisieren und so ein Kollagen-Binärbild zu erstellen. Ein ähnliches Schema wurde auf den roten Kanal (TPE) angewendet, um ein binäres Gewebebild zu erstellen.

Die erfassten Biopsieprobenbilder umfassten zwei unterschiedliche Regionen: (i) Regionen, die ein hochkonzentriertes Kollagenkompartiment enthalten (Abb. 2A, gelber Pfeil) und (ii) Regionen, die gleichmäßig und spärlich verteilte Kollagenfasern enthalten (Abb. 2A, weißer Pfeil). Basierend auf der Intensität und Morphologie des SHG-Signals wurde eine neuartige rechnerische Filterpipeline entwickelt, um das Kollagen in diese beiden unterschiedlichen Modi zu kategorisieren: Aggregated Thick Collagen (ATC) und Dispersed Thin Collagen (DTC). Anschließend wurden Intensität/Fläche, Textur, Struktur und Faserverteilungsmerkmale gemessen. Jedes Merkmal wird in den Geweberegionen ATC, DTC und „ALL“ (die Kombination aus ATC und DTC) gemessen. Eine nicht erschöpfende Liste der Funktionen und ihrer Definitionen finden Sie in Supp. Tabelle 1. Die Merkmale wurden in die folgenden Kategorien eingeteilt: Textur, Dicke, Länge, Geradheit und Ausrichtung. Nachdem die Merkmale aus den Bildern extrahiert worden waren, wurden ihre Beziehungen zu klinisch-pathologischen Merkmalen bewertet. Statistisch signifikante Zusammenhänge (p < 0,05) werden dargestellt.

Es gibt 41 Merkmale, die aus den Bildern der Biopsien von Patienten extrahiert wurden, und alle Merkmale sind entsprechend in zwei Gruppen unterteilt, nämlich reversibel und irreversibel. Der T-Test wurde durchgeführt, um die markantesten Merkmale zu finden, die zwischen den beiden Gruppen unterscheiden können. Für die weitere Untersuchung wurden vier Merkmale ausgewählt, die einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) zwischen zwei Patientengruppen aufweisen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor (WY) erhältlich.

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Diese Forschung wurde gemeinsam durch das 12. Gemeinsame Forschungsprogramm Singapur-China (SG-CN JRP) mit der Projektnummer 1610500026 finanziert, vergeben an Prof. Lai WEI, und Dr. Yu Weimiao, China-Singapore International S&T Cooperation Program (2016YFE0116800), Zuschüsse von das China National Science and Technology Major Project for Infectious Diseases Control während der 13. Fünfjahresplanperiode (2017ZX10202202, 2018ZX09201002-001-005), die National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81870406, 81870407) und die Beijing Natural Science Foundation (7182174). Dieses Projekt wird gemeinsam durch die Forschungsförderung A*STAR BII und den 2021 an Dr. Yu Weimiao verliehenen BMRC-Stipendium für angewandte und translationale Forschung (ATR) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Laurent Gole, Feng Liu und Kok Haur Ong.

Institut für Molekular- und Zellbiologie, A*STAR, 61 Biopolis Drive, Proteos Building, Singapur, 138673, Singapur

Laurent Gole, Kok Haur Ong, Longjie Li, Hao Han, David Young, Gabriel Pik Liang Marini und Weimiao Yu

Volkskrankenhaus der Universität Peking, Hepatologisches Institut der Universität Peking, Pekinger Schlüssellabor für Hepatitis C und Immuntherapie bei Lebererkrankungen, Nr. 11, Xi Zhimen South Street, Peking, 100044, Volksrepublik China

Feng Liu, Huiying Rao und Lai Wei

Abteilung für Pathologie, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Hospital, Singapur, Singapur

Aileen Way

Abteilung für Pathologie, Fünftes Medizinisches Zentrum des PLA General Hospital, Peking, 100039, China

Jingmin Zhao

Abteilung für Hepatobiliäres und Pankreaszentrum, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua University, Beijing, 102218, China

Lai Wei

Bioinformatik-Institut, A*STAR, Singapur, Singapur

Kok Haur Ong, Longjie Li, Gabriel Pik Liang Marini und Weimiao Yu

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FL, HR und LW organisierten die Patientenkohorte und bereiteten Gewebeproben vor; LG, KO, WY entwarf und implementierte die Algorithmen und Software für die Kollagenbildverarbeitung; AW und JZ stellten pathologische Diagnosedaten zur Verfügung. KO, LG, WY, LL, DY und GM trugen zur Überarbeitung des Manuskripts, zur Abbildung und zum Grafikdesign bei. HH, LL und LG führten die statistische Analyse durch. HR, WY und LW haben das Experiment entworfen. Alle Autoren haben zur Erstellung und Überarbeitung des Manuskripts beigetragen. Alle Autoren dieser Arbeit stimmten zu, nach der Annahme mit Scientific Reports zu veröffentlichen.

Korrespondenz mit Huiying Rao, Weimiao Yu oder Lai Wei.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gole, L., Liu, F., Ong, KH et al. Quantitative bildbasierte Kollagenstrukturmerkmale sagen die Reversibilität einer durch das Hepatitis-C-Virus verursachten Leberfibrose nach antiviralen Therapien voraus. Sci Rep 13, 6384 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33567-4

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Eingegangen: 13. Oktober 2022

Angenommen: 14. April 2023

Veröffentlicht: 19. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33567-4

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